新冠肺炎病毒SARS-CoV-2国内检测方法汇总

武英，周洪彬，张珏，高莉，李文赟，吴虹丽，吴小林

(成都大学，四川抗菌素工业研究所，抗生素研究与再评价四川省重点实验室，成都 610052)

新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2的检测方法主要有全基因组测序、核酸检测法和免疫学检测法。由于对整个基因组测序对实验条件、设施、人员要求高，检测时间长，不能满足快速筛查需要。核酸检测和免疫学检测方法是目前普遍采用的方法。我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》[1]明确指出SARS-CoV-2确诊需具有以下病原学证据之一：(1)新型冠状病毒核酸RT-PCR检测阳性；
(2)病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。RT-PCR检测只需要检测病毒的特异性基因，不用对整个基因组测序，大大提高了核酸检测的效率。为了进一步增加新冠肺炎确诊的准确性和效率，国家卫生健康委员会发布的最新版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》将免疫学检测法与核酸检测、病毒基因测序列一起列为疑似病例确诊的病原学证据之一[2]。免疫学检测法是检测人体免疫系统防御新冠肺炎病毒产生的特异性抗体，包括胶体金法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光免疫分析(CLIA)、量子荧光免疫层析法技术。

本文综述了目前国家食品药品监督管理局(NMPA)审批通过的SARS-CoV-2 检测试剂盒的技术方法，分析了其优势和限制，并对新型的病毒检测技术做出了展望。

截止2020年6月，我国食品药品监督管理局审核批准生产的新冠肺炎病毒SARS-CoV-2检测试剂盒有43种，20种是核酸检测试剂盒，其中22种是免疫学检测试剂盒，1种是全基因组测序试剂盒，需要配合基因组测序系统使用(见表1)。

核酸检测法是对病毒RNA 基因组进行检测，主要分为全基因测序和特异性基因检测。由于全基因组测序不适用于临床快速检测的要求，所以目前新冠肺炎病毒核酸检测手段主要以检测特异性基因为主，主要检测手段有：荧光定量PCR法、微RNA捕获探针法、杂交捕获免疫荧光法、双扩增法、RNA恒温扩增-金探针层析法和恒温扩增-实时荧光法等技术。免疫学检测试剂盒的检测目标物主要是新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM、IgG抗体以及N-蛋白。检测方法为胶体金法、酶联免疫法、上转发光免疫层析法、量子点荧光免疫层析、化学发光法、直接化学发光法和磁微粒化学发光法。

2.1 检测目标基因

SARS-CoV-2基因组测序解析工作已经完成[3-4]，其基因组含有约29 000 个碱基，12个蛋白编码区/开放读码框(ORF)。其中ORF 1ab 区域的RNA 聚合酶基因(RdRp)编码的RNA 聚合酶，是病毒RNA复制所必需的核心蛋白[3]。E 区编码囊膜蛋白，形成病毒包膜及病毒颗粒。N 区编码核壳蛋白，识别宿主RNA。

由于SARS-CoV-2的RdRp 基因在进化树上与SARS病毒(SARS-CoV-3)的RdRp 基因显著不同，因此被定义为一种新的β属冠状病毒，而且其所在开放阅读框ORF 1ab 区域变异性相对较小[5]，因此 RdRp 基因所在区域ORF 1ab 也成为鉴定SARSCoV-2核酸的一个重要标志物。此外，检测E蛋白基因和N蛋白基因序列也是确认SARS-CoV-2是否存在的重要依据[6]。

表1 国内已取得生产批号的试剂盒

2.2 我国核酸检测试剂盒的主要方法

2.2.1 荧光PCR法

目前我国最常用的是实时荧光逆转录PCR 法(RT-PCR)，20种检测试剂盒中15种是采用荧光PCR法。检测目标基因是ORF 1ab基因、囊膜蛋白E基因和核壳蛋白N基因。由于 RNA 病毒容易发生变异，为有效地避免假阳性和假阴性，目前SARS-CoV-2 的PCR 检测一般会同时检测 ORF1ab 基因和N 基因，有时还 会在增加检测E基因。

我国批准生产的试剂盒中仅检测ORF 1ab基因的试剂盒有2种，检测ORF 1ab和N基因的有9种，能够检测ORF1ab和N基因、E基因三个基因的有4种。

实时荧光PCR法，速度较快、成本相对较低。是我国目前SARS-CoV-2检测试剂盒中常用的检测方法。第一步需要进行逆转录反应(RT)，然后进行PCR扩增。商品化试剂盒通常把RT反应液与PCR 反应液预混在一起，在密闭环境中一步完成逆转录与扩增检测。操作简便，且明显降低开盖导致的外源性污染的风险[7]。

此技术的核心是设计出灵敏度好、特异性强的PCR 引物和荧光探针。理想的引物和荧光探针不仅能高效地扩增出SARS-CoV-2 基因组的片段，降低假阴性率，又能有效区分SARS-CoV-2 基因组和其他常见冠状病毒及流感病毒的基因组，降低假阳性率[8]。

郭元元等人[9]对6 家公司的核酸检测试剂盒的检测性能进行了比较。发现只有2 种试剂盒能够同时扩增出ORF1ab 基因和N 基因，其余4 种试剂盒只能扩增出其中一个基因。此外，不同试剂盒同一批次内检测的重复性也不一致。随患者病情发展，只有3种试剂盒能检测出病毒基因拷贝数呈现增加的趋势。表明不同厂家的检测试剂盒在灵敏度、稳定性等方面还有进一步提高。

2.2.2 恒温扩增-实时荧光法(RT-LAMP)

逆转录环介导恒温实时扩增法(RT-LAMP)是2000年由日本研究人员NOTOMI T 等[10]发明的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。其技术优势在于整个反应过程只需要在恒温环境下进行，避免因变温热循环而延长检测时间。反应结束后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料判断扩增情况。Yang[11]等人的团队开发的 RTLAMP法可同时检测 SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因、E基因和 N 基因，所检测的 208 个临床标本的特异性为 99%。Yu[12]等人将这种恒温扩增-实时荧光法用于检测SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因发现其检测下限最低可达10个拷贝，样品反应时间也比RT-PCR快，且不需要复杂的检测仪器。Yang[13]等人的实验也证明RT-LAMP的扩增效率优于RT-PCR只需一个在60～65℃恒温条件进行扩增，通常在 1 h 内即可完成病毒核酸的检测。具有灵敏度高，反应迅速等优点。由于其不需要昂贵的设备，可在短时间内快速获得结果。所以适用于入境口岸的快速筛查工作。

2.2.3 RNA捕获探针法

RNA捕获探针法利用特异性靶标捕获技术(磁珠法)快速捕获靶标基因片段，然后再结合高分辨分子信标检测技术，能够提高病毒的检测灵敏度和特异性。这种特异性靶标捕获技术是将磁珠微粒表面标记一段多聚胸腺嘧啶寡核苷酸(Oligo,dT)，与一段带有Oligo(dA)的特异性的核酸捕获片段配对结合。当带有Oligo(dA)的捕获探针与靶标核酸结合后，用磁铁吸附磁珠，即可将靶标核酸特异性的提取出来。而且样本RNA可以常温保存，全流程标准化操作，排除人为偏差，可以实现高通量检测，全程仅需90分钟[14]。

2020年3月4日国家卫健委发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》提出新增SARS-CoV-2血清抗体检测作为辅助检测手段，指明特异性IgM和IgG阳性、IgG由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高可作为SARS-CoV-2确诊感染的血清学证据[15]。进一步指出抗体检测不仅需要定量，且在患者治疗过程中以及康复诊断出院时均需要检测。

免疫学检测方法作为SARS-CoV-2快速确诊的辅助检测手段，不仅能够降低假阴性的概率，还可降低医务人员在呼吸道标本采集过程中的暴露风险。目前已在全国广泛地推广和应用。

我国通过审批的抗体检测试剂盒生产厂家有22家，主要检测方法为胶体金免疫层析法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法、上转发光免疫层析法、量子点荧光免疫层析、化学发光法、直接化学发光法和等。前三种方法是我国采用的主要检测方法。

3.1 胶体金免疫层析法(GICA法)

胶体金法检测抗体的原理是基于抗原抗体的特异性结合和显色原理。将特异性抗原与胶体金结合并固定在结合垫上，当检测样品中有目标抗体出现时，抗体与试剂盒中的金标抗原结合，产生抗原抗体复合物，剂盒中的特异性抗体会捕获这种带有显色标志的抗原抗体复合物，检测样品呈阳性。若待测样品中不含目标抗体，则不显色，检测样品呈阴性[16]。该技术现已发展成为诊断试纸条的形式，检测样品可采用静脉全血、血清或血浆样品，将样品与稀释剂混合，10～15 min后可通过测试条上测试线与对照线的颜色来判断结果[17]，快速又便捷。

张稳健等[18]测试了胶体金免疫层析法(GICA法)在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用价值。结果表明，在105例SARS-CoV-2 核酸检测阳性病例中，胶体金法检测IgM和IgG 抗体的敏感性分别为76.2%和86.6%，IgM/IgG 抗体阳性总体符合率为96.1%。表明该方法具有较好的敏感性及特异性，可用于临床辅助诊断和流行病学调查。并且标本采集易标准化，检测时间短。但是该方法会受到血清中类风湿因子(RF)的干扰[19]，从而导致假阳性的出现。

3.2 磁微粒化学发光法

目前国家食品药品监督管理局(NMPA)通过审批的22个抗体检测试剂盒中有7个是采用了磁微粒化学发光免疫技术。该技术主要是利用磁微粒作为载体，通过增加表面积和加入外磁场，来提高高灵敏度和检测速度[17]。赵宗瑞等人[20]用CLSI(美国临床实验室标准化协会)EP12-A2和EP15-A2文件两种方法评估磁微粒化学发光免疫试剂的精密性。其研究表明全自动磁微粒化学发光法用于检测呼吸道合胞病毒IgM抗体精密性良好，临床诊断标准符合率高于与同类ELISA方法试剂，可满足临床应用需求。张立娟[21]分别采用磁微粒化学发光法和酶联免疫吸附法对166例自身免疫病患者血清和50 例健康者血清中抗 PR3抗体、抗 MPO 抗体进行定量检测，磁微粒化学发光法的批内、批间重复性都优于酶联免疫吸附法，准确度符合要求。但是由于检测试剂特殊，盒成本较高，且需要特定的化学发光仪才，因此使用范围也收到一定的限制。

3.3 化学发光法

化学发光法其技术特点在于采用了氧化剂或酶的发光底物作为化学发光物质，经过氧化反应后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量。形成的中间体越多，发射的光子越多，可以通过发光信号测量仪器进行定量检测[22]。其中，直接化学发光法不同之处在于所用的发光剂在化学结构上有产生发光的特有基团，在发光免疫分析过程中不需要酶的催化作用，直接参与发光反应，可直接标记抗原或抗体。目前常见的直接化学发光标记物主要有吖啶酯类化学发光剂[23]。

化学发光法特异性高、线性范围宽、速度快，已广泛应用于呼吸道病原体的检测[24]。田鹏鹏[25]等人收集了108例SARS-CoV-2患者和23例疑似患者以及其他病例90例，采用化学发光法检测所有研究对象的SARS-CoV-2 特异性IgM和IgG抗体，核酸RT-PCR检测结果作为比对。结果表明化学发光法检测IgM/IgG的敏感性、特异性、准确性、分别为98.1%、89.4%、93.7%，化学发光法检测联合RTPCR可以更好地排除或确诊，避免疾病漏诊。

随着SARS-CoV-2 病毒在全球蔓延，在尚无特效药物和疫苗的情况下，快速检测出病毒携带者并将之隔离是阻断病毒传播最有效的方式。因此迫切需要大量快速、准确的检测试剂盒。目前，各国科研工作者也紧急开发各种检测手段，使得检测技术突飞猛进。麻省理工学院的张锋教授[26]基于CRISPR 基因编辑技术开发了一种快速高效而且操作简便的检测 SARSCoV-2 的新方法，在后续的研究中利用合成的 SARSCoV-2 RNA 片段进行了测试，发现该技术能够在很低的病毒 RNA 溶度下(10～100 拷贝/μL)准确的检测到 SARS-CoV-2 RNA 序列，耗时不超过1h[27]。

目前核酸检测仍然是确诊SARS-CoV-2 的金标准，但由于在取样部位、样本采集、设备仪器以及试剂盒引物设计等多方面不可控因素的存在，不可避免地会出现“假阴性”问题。加之操作步骤较多、耗时较长，对实验室人员技术要求较高，在快速筛查大量疑似患者和密切接触人群时仍有诸多不便。因此抗体检测作为辅助检测手段也得到了发展。但是抗体检测由于受到内源性干扰物(类风湿因子、嗜异性抗体、补体等)和外源性干扰物(标本溶血、被细菌污染、贮存时间过长或凝固不全)等因素的影响，会出现“假阳性”[28]。因此，在诊断SARSCoV-2过程中，建议核酸检测联合抗体和影像学检测综合判断，以做出最终诊断意见。