软骨母细胞瘤中,H,3.3组蛋白基因突变检测及其临床意义△

罗威，董金波，古家美，王芳，吴小延#

中山大学肿瘤防治中心1影像科，2分子诊断科，广州 510060

软骨母细胞瘤（chondroblastoma，CB）是一种罕见的良性软骨瘤，约占所有骨肿瘤的1%，通常累及长骨的骨骺，多见于20～30岁的患者，多发生于骨骼未成熟患者的骨骺处，男性多见[1-2]。CB并不经常导致患者死亡，但CB与其他骨肿瘤具有重叠特征，例如软骨黏液样纤维瘤（chondromyxoid fibroma，CMF）和骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB），导致有时难以诊断CB[3]。以往的研究发现，95%的CB在H3组蛋白成员H3.3组蛋白A（H3.3 histone A，H3F3A）（1号染色体）和H3.3组蛋白B（H3.3 histone B，H3F3B）（17号染色体）中存在p.K36M突变，其中大多数涉及H3F3B[4]。在CB中，组蛋白H3.3的36位赖氨酸至甲硫氨酸（H3K36M）突变蛋白与组蛋白H3.3的36位赖氨酸（H3K36）的SET结构域2，组蛋白赖氨酸甲基转移酶（SET domain containing 2,histone lysine methyltransferase，SETD2）紧密结合，竞争性抑制它们与共同表达的野生型H3组蛋白结合，从而导致H3K36甲基化异常[5-6]。CB的产生与H3组蛋白第36位赖氨酸甲基化（H3K36me）突变过程有关[5,7]。H3K36me是一种参与表观遗传调控的组蛋白修饰蛋白，在DNA复制、转录、重组和DNA损伤修复[8]等生物学过程中发挥重要作用。突变的组蛋白H3K36多肽或核小体可显著下调组蛋白H3K36甲基转移酶SETD2的活性，重组H3K36me甲基化情况，并通过改变肿瘤相关基因[6,9]的表达来促进CB的发生。因此，H3.3组蛋白（H3.3 histone，H3F3）基因中的K36M位点是诊断CB灵敏度和特异度均较好的标志物[10]。本研究通过检测CB和其他骨肿瘤中H3F3基因突变状态，分析H3F3基因突变与CB临床特征的关系，为深入探讨H3F3基因在CB发病机制中的作用提供理论基础，现报道如下。

1.1 一般资料

收集2018年5月至2022年8月中山大学肿瘤防治中心分子诊断科存档的CB患者的病历资料。纳入标准：①有基本的临床资料；
②经手术组织病理学明确诊断为CB。排除标准：①骨肿瘤类型不明确；
②临床资料不完整。根据纳入、排除标准，共纳入31例CB患者，其中，男性20例，女性11例；
年龄11～36岁，平均（19.5±7.4）岁；
股骨为最常见的发病部位，其次为肱骨。另选取24例GCTB、7例动脉瘤样骨囊肿、1例非骨化性纤维瘤、9例软骨源性肿瘤（1例CMF、1例内生性软骨瘤、5例间叶性软骨肉瘤、1例透明细胞软骨肉瘤、1例继发性软骨肉瘤）、9例骨肉瘤（8例普通型骨肉瘤及1例低级别骨肉瘤）患者的肿瘤组织。所有肿瘤组织均采用中性缓冲甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。由3位病理科医师检查每个肿瘤组织的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色的载玻片，并从中选择合适的石蜡块用于Sanger测序。

1.2 检测方法

1.2.1 试剂与仪器核酸提取试剂盒购自基因科技股份有限公司，通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。NanoDrop1000超微量分光光度计购自美国Nanodrop公司，ABI 3500XL聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2.2 HE染色将3 μm厚的组织切片置于载玻片上，在4%多聚甲醛中浸泡4 h，然后转移至70%乙醇中。将切片放入处理盒中，通过一系列乙醇梯度脱水，并嵌入石蜡块中。染色前，切片在二甲苯中脱蜡，通过降低乙醇浓度再水化，并在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）中洗涤，然后用HE染色。染色后，切片通过增加浓度的乙醇和二甲苯脱水。

1.2.3 测定DNA浓度和纯度甲醛固定石蜡包埋组织，采用核酸提取试剂盒提取组织样本DNA。病理科医师根据HE染色选取＞50%的肿瘤组织蜡块，3 μm厚连续切片10张，用石蜡贴片机贴于载玻片上，二甲苯脱蜡后严格按照试剂盒说明书进行操作，提取完毕后使用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度。

1.2.4 Sanger测序法使用PCR仪扩增H3F3B及H3F3A的36号密码子目的片段，引物由上海生工生物公司合成，H3F3A上游引物序列为5"-GGCTCGTACAAAGCAGAC-3"，下游引物序列为5"-CAGTACATTTATTTAAGCAGTAG-3"，长度为277 bp。H3F3B上游引物序列为5"-CACGAAAGCCGCCAGGAA-3"，下游引物序列为5"-CAGCGAGCAGGGGAGGAGT-3"，长度为 143 bp。PCR 反应体系为 2×Premix EX TapTM12.5 μl，上、下游引物（10 μmmol/L）各 1.0 μl，DNA 模板 5.0 μl，去离子水5.5 μl，总体系 25.0 μl。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环10次；
94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次；
72℃延伸5 min，12℃保温。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。使用ABI 3500XL型测序分析仪进行双向测序，使用Chromas软件与基因组DNA序列进行比对。根据碱基信号峰图判定是否存在突变。

1.3 统计学方法

采用R语言进行统计分析。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用非参数秩和检验；
计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 CB和其他骨肿瘤中 H3F3基因测序结果

基因突变分析显示，31例CB中H3F3基因突变阳性率为80.6%，其中H3F3BK36M突变24例，H3F3AK36M突变1例（图1），而其他骨肿瘤中均未发现H3F3基因突变。

图1 CB病例基因突变的Sanger测序分析

2.2 H3F3基因突变与CB临床特征的关系

不同H3F3基因突变状态的CB患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同 H 3 F 3基因突变状态CB患者临床特征的比较

CB作为一种良性软骨瘤，由于与其他骨肿瘤的特征重叠，有时难以确诊。在形态学基础上通过有限的穿刺活检区分这些肿瘤类型特别困难，因此分子检测（或免疫组化）对于鉴别诊断至关重要。CB在第4版世界卫生组织分类中被归类为具有中等生物学潜力的肿瘤[11]，而在第5版中被重新归类为良性肿瘤[12]。Behjati等[7]的研究显示，组蛋白H3K36M和H3G34W的突变分别是CB和GCTB产生的驱动突变。本研究通过DNA测序分析显示，25例CB都具有这种精确的遗传改变，显示出这种突变的独特性。此外，通过DNA测序分析评估的其他6例CB和50例其他类型骨肿瘤均未显示突变。

本研究发现，31例CB中有80.6%的病例出现H3F3基因突变，以H3F3BK36M突变为主，其他骨肿瘤中均无突变，表明这种H3F3K36M基因突变对CB具有独特性，并且根据之前的研究显示，有96%的CB具有p.K36M突变[11]，因此该突变检测方法代表了一种有价值的工具，该基因突变可用于区分CB和其他原发性骨肿瘤。此外，由于只有约4%的CB不存在H3F3p.K36M突变，因此未能检测到突变时应该考虑其他组织类型，并且要谨慎诊断CB。

除CB外，透明细胞软骨肉瘤是唯一检测到p.K36M突变的软组织肿瘤，它是一种恶性骨肿瘤，仅占所有软骨肉瘤的2%[11]。透明细胞软骨肉瘤与CB有许多重叠的临床特征和放射学特征，包括肿瘤发病部位，但透明细胞软骨肉瘤需要整体切除，而CB通常是刮除术。透明细胞软骨肉瘤最常见于30～40岁患者的股骨近端和肱骨，而CB最常见于20～30岁患者的股骨远端和胫骨近端。然而，两者都可以出现在年龄＞40岁的患者中，并且可以出现在身体的任何骨骼中。在影像学特征中，透明细胞软骨肉瘤很难与CB区分，因为两种肿瘤类型在MRI上的信号强度非常不均匀。尽管与CB相比，透明细胞软骨肉瘤通常较大，瘤周水肿和关节滑膜炎不太明显，但这些标准不足以区分这两种肿瘤[13]。本研究中并未发现透明细胞软骨肉瘤有p.K36M突变的情况，或许需要更多的实验数据来证实。

CB偶尔可以与传统的中央/表面软骨肿瘤、间充质软骨肉瘤共享形态学表现。然而本研究显示，在这些肿瘤中未显示有H3F3K36M基因突变的情况，证明了该标志物的独特价值。区分CB和软骨母细胞骨肉瘤可能具有挑战性，不仅因为形态重叠，而且在极少数情况下，CB会转移到肺部。这种病变可以通过从肺部切除来控制，而不会导致疾病进展。区分这两种肿瘤对于提供适当的临床治疗至关重要，这涉及骨肉瘤患者的新辅助化疗。有一种异常罕见的骨肉瘤变体，称为软骨母细胞瘤样骨肉瘤，这种肿瘤与其良性对应物的组织学表型相似，但显示具有核异型性和渗透性生长模式[14]。

CB富含的破骨细胞成分与其他富含破骨细胞的骨肿瘤重叠，包括GCTB、动脉瘤性骨囊肿及非骨化性纤维瘤等骨肿瘤。本研究及之前的文献表明，这些不含有H3F3p.K36M突变[15]。尽管96%的GCTB和70%的动脉瘤样骨囊肿分别具有H3F3G34突变和USP6重排，但尚未报道其他富含破骨细胞肿瘤的诊断性生物标志物[16-18]。因此，H3F3K36M突变可用于排除这些诊断。

综上所述，H3F3p.K36M突变在CB中具有独特性，H3F3p.K36M突变是一种有价值的诊断工具，病理科医师可以使用它来快速、低成本地提供更准确的诊断。