RNA干扰抑制CD147表达对宫颈癌细胞增殖、转移和侵袭能力的影响

曹勋荣 吕桂雪 魏雯雯 （济南市第二妇幼保健院妇产科，济南 271100）

宫颈癌是常见生殖系统恶性肿瘤之一，原位癌多发生于20～45 岁，而鳞状浸润性癌高发年龄为45～55 岁，是女性癌症死亡的主要原因之一，尤其在发展中地区发病率和病死率更高。宫颈癌发病部位隐匿，缺乏典型早期临床症状，且肿瘤细胞具有超强恶性增殖及靶器官转移能力，病情进展迅速，多数患者确诊时已进入中晚期，错过了手术切除的最佳时机［1］。研究显示，复发及恶性侵袭是中晚期宫颈癌患者失去生命的重要原因［2］。因此从疾病分子机制入手，积极探索癌细胞增殖、转移的特异性分子标志物，不仅有利于宫颈癌早期诊断，更有助于靶向治疗开展，降低患者病死率。胞外基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN，又称CD147）是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。研究显示，CD147 能增强肿瘤细胞MMPs 表达，促进癌细胞浸润、侵袭、黏附和恶性转移［3］。CD147 在喉鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺浸润性导管癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达升高，且伴有单羧酸转运蛋白1（monocarboxylate transporter 1，MCT1）高表达，而异常表达CD147 和MCT1的肿瘤患者预后不良［4］。但关于CD147在宫颈癌中作用的报道较少。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种借助基因技术手段沉默目的基因表达的RNA 干扰技术［5］。本研究探讨临床宫颈癌组织及宫颈癌细胞中CD147 表达，借助RNAi 技术探究其对宫颈癌细胞增殖、侵袭和转移的影响，为宫颈癌靶向治疗提供可靠靶点。

1.1 资料

1.1.1 临床组织样本 选取2016 年2 月至2019 年2 月济南市第二妇幼保健院病理组织室110 份宫颈组织，包括20 例正常宫颈上皮组织和90 例宫颈癌组织（30 例原位宫颈癌组织和60 例鳞状宫颈癌组织）。所有患者均是首次确诊，且未进行放化疗及免疫、内分泌等干预。患者年龄、生育与否、身高、体重等差异无统计学意义（P＞0.05）。患者或家属知情同意。本研究经济南市第二妇幼保健院伦理委员会批准。

1.1.2 实验动物、细胞及主要试剂 30 只SPF 级4～6 周龄SD 裸鼠（130～180 g）由广东莱恩医药研究院有限公司提供，许可证号：SYXK（粤）2021-0246，饲养于济南市第二妇幼保健院SPF 级动物房，自由摄食饮水，恒温恒湿下适应性喂养1 周用于实验；
HeLa 宫颈癌细胞株由美国菌种保藏中心（ATCC）提供；
利用RNAi 及构建的腺病毒介导的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-shRNA-CD147 及GFP-shRNA-CD147-NC质粒由上海吉玛基因公司提供；
大鼠抗人GAPDH、兔抗人CD147、MCT1抗体（美国Abcam 公司）；
EdU 试剂盒、免疫组化试剂盒、Transwell 小室、Western blot 试剂盒（上海碧云天生物有限公司）；
微量加样器（德国Eppendorf公司）；
智能细胞培养箱（日本三洋公司）；

IXplore Standard 倒置显微镜（日本Olympus 公司）；
实时荧光定量PCR仪（美国ABI 公司）；
荧光显微镜（日本Nikon 公司）；
凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测临床样本中CD147 表达 将样本组织常规固定，石蜡包埋，制成4 µm切片，枸橼酸缓冲液修复，过氧化氢阻断，加入一抗4 ℃暗盒孵育过夜，加入二抗，显色，清洗，复染，脱水，透明，封片，镜检，以视野中出现棕黄色颗粒为阳性［6］，每个样本随机选取5个视野由两位资深病理研究人员根据染色强度和阳性细胞比例判断CD147 阳性与阴性表达，并将CD147 表达与患者年龄、肿瘤大小、浸润深度、临床分期和淋巴转移情况等临床病理参数进行相关性分析。

1.2.2 细胞转染 复苏HeLa 细胞，接种于含灭活10%胎牛血清的DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2恒温恒湿培养，细胞生长密度达85%时开始实验。以GFP-shRNA-CD147-NC 和GFP-shRNA-CD147 分 别转染对照组和实验组细胞，另取空白细胞作为正常组，3组细胞均常规培养24 h，荧光显微镜观察，PCR仪测定转染效率。

1.2.3 各组细胞形态改变 调整细胞浓度，以5×104个/孔接种于6 孔板，分组处理同上，轻轻混匀后恒温恒湿常规培养24 h，10%甲醛固定，倒置相差显微镜下观察。

1.2.4 EdU 标记实验检测各组细胞增殖能力 调整细胞浓度，以5×104个/孔接种于6 孔板，分组处理同上，轻轻混匀后恒温恒湿常规培养24 h，10%甲醛固定并进行EdU实验，严格按照试剂盒要求操作。

1.2.5 Transwell 检测各组细胞迁移和侵袭能力 在Transwell 小室平板平铺一层Matrigel 基质胶（约50 µl），并将无血清培养基中的各组单细胞悬液加至上室（侵袭实验中铺Matrigel 胶，迁移实验中不铺胶），小室下室平铺含灭活10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2常规培养24 h，清洗，甲醛固定，染色，显微镜下观察并计数穿膜细胞。

1.2.6 裸鼠成瘤模型检测各组细胞体内生长与转移能力 调整细胞浓度，以1×106个/孔接种于24 孔板，分组处理同上，常规培养至密度为1×107个/ml时，以新的培养液将细胞制成单细胞悬液。将裸鼠随机分为正常组、对照组、实验组，诱导麻醉后，在每只裸鼠背部皮下注射100 µl 对应组细胞悬液，尾静脉注射1 µmol/L Luciferin 剂后连接活体成像系统（IVIS），实时监测裸鼠病灶转移，采用系统自带软件统计分析荧光分布及强度，得到病灶转移比例，4 周后留取图像，处死动物，取各组动物瘤体组织称重。

1.2.7 Western blot 检测各组细胞CD147、MCT1 表达 胰酶消化细胞，离心稀释成单细胞悬液，分组处理同上，按1×105个/孔接种至6 孔板，5%CO2、37 ℃培养24 h，加入蛋白裂解液，分别提取各组细胞总蛋白，测定浓度，沸水变性，电泳分离，转膜，清洗，封闭液孵育30 min，加入一抗（1∶500）孵育过夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，以GAPDH 为内参，Image J 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验进行分析，所有数据符合正态分布，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 CD147表达 免疫组化结果显示，与正常宫颈组织相比，原位宫颈癌组织中CD147 阳性表达比例明显升高，与原位宫颈癌组织相比，鳞状宫颈癌组织中CD147阳性表达比例明显升高（均P＜0.05），说明CD147表达与宫颈癌病情进展关系密切（图1）。

图1 CD147表达（×400）Fig.1 CD147 expression （×400）

2.2 CD147 表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系 相关性分析结果显示，CD147 表达与宫颈癌患者年龄及临床分期无关（P＞0.05），与肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移关系密切（均P＜0.05，表1）。

表1 CD147 表达与宫颈癌患者临床病理参数的相关性 （n=90）Tab.1 Relationship between expression of CD147 and clinicopathological parameters of cervical cancer patients （n=90）

2.3 细胞转染 荧光显微镜观察结果显示，对照组与实验组细胞均有明显荧光出现，PCR 结果显示，与正常组相比，实验组细胞CD147 mRNA 表达明显降低，说明转染成功（图2）。

图2 细胞转染（×400）Fig.2 Cell transfection （×400）

2.4 各组细胞形态变化 倒置相差显微镜观察显示，正常组和对照组细胞贴壁生长良好，排列规整，胞质界限清晰，胞浆中核糖体、线粒体等细胞器形态稳定，核膜完整；
实验组细胞生长趋于缓慢，且排列紊乱，胞浆中空泡样变性明显，部分细胞核膜缺损严重，染色体聚集明显，培养基中出现一定量漂浮细胞，说明沉默CD147 表达后，宫颈癌细胞形态发生改变，CD147 表达在宫颈癌细胞稳定形态维系中发挥重要作用（图3）。

图3 各组细胞形态（×400）Fig.3 Cell morphology of each group （×400）

2.5 各组细胞增殖能力 EdU标记后，与正常组相比，实验组细胞EdU 阳性细胞比例明显下降（P＜0.05）。正常组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），说明干扰CD147 表达后，宫颈癌细胞增殖能力明显受限（图4）。

图4 EdU染色（×400）Fig.4 EdU staining （×400）

2.6 各组细胞迁移和侵袭能力 Transwell 结果显示，与正常组相比，实验组细胞迁移数和通过Matrigel 基质胶数明显减少（均P＜0.05）；
正常组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），说明干扰CD147 表达后，宫颈癌细胞侵袭与迁移能力明显下降（图5、图6）。

图5 细胞迁移（×400）Fig.5 Cell migration （×400）

图6 细胞侵袭（×400）Fig.6 Cell invasion （×400）

2.7 各组细胞体内生长与转移 裸鼠成瘤实验结果显示，与正常组相比，4 周后，实验组裸鼠内移植瘤明显变小，瘤体重量明显减少（P＜0.05），正常组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05，图7）。裸鼠体内病灶转移情况结果显示，与正常组相比，4 周后，实验组裸鼠内种植瘤病灶转移比例明显降低 （P＜0.05），正常组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），说明干扰CD147 表达后，宫颈癌细胞体内生长与恶性转移能力明显下降（图8）。

图7 裸鼠成瘤Fig.7 Tumor formation in nude mice

图8 病灶转移图像Fig.8 Metastasis image

2.8 各组细胞CD147、MCT1 表达 CD147 的基因ID 为BSG，MCT1 的基因ID 为SLC16A1，GENEMANIA 数据库（http://genemania.org/）发现CD147 和MCT1存在特异性调控位点（图9）；
Western blot结果显示，与正常组相比，实验组细胞CD147、MCT1 蛋白表达明显降低（P＜0.05），正常组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），说明干扰CD147 表达后，宫颈癌细胞CD147和MCT1表达明显下降（图10）。

图9 CD147与MCT1存在特异性调控位点Fig.9 Specific regulatory sites between CD147 and MCT1

图10 各组细胞CD147、MCT1表达Fig.10 CD147 and MCT1 expressions of cells in each group

作为妇科常见恶性肿瘤，宫颈癌多发生于20～55 岁女性，严重威胁全球女性健康。随着社会发展，生活方式转变，尽管宫颈癌早期筛查技术有所提高，但发病年龄日趋年轻化，尚未生育患者增多，患者再次复发及转移率不断升高，多数宫颈癌患者长期生存率并不令人满意［7］。宫颈癌分子机制错综复杂，尚处于实验研究阶段，寻找疾病进展的潜在分子标志物，积极开发行而有效的分子靶向药物是临床医师面临的重大挑战之一。

CD147 是一种定位于细胞膜表面的约为58 kD的跨膜蛋白，在人体胸腺细胞、上皮细胞等多种细胞和组织中表达。研究显示，CD147 在正常组织或细胞表达较低，在泌尿系统肿瘤、卵巢癌、肝癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达升高，因此CD147是恶性肿瘤靶向治疗的研究热点［8］。FANG 等［9］研究显示，CD147 在前列腺癌中表达升高，且升高的CD147 介导Wnt/β-catenin 途径，推动肿瘤细胞上皮-间质转化，促进患者病情进展。MIN等［10］研究显示，在肾细胞癌中抑制CD147 表达，能明显抑制肿瘤细胞能量代谢，下调癌细胞增殖能力。YIN 等［11］研究显示，食管鳞状细胞癌系中CD147 表达升高，干扰其表达能明显抑制肿瘤细胞体内外增殖与侵袭能力。本研究免疫组化结果显示，CD147 在宫颈癌组织表达升高，其表达升高伴随病情进展，相关性分析结果显示，CD147表达与宫颈癌患者肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移关系密切，说明在宫颈癌中研究CD147 表达具有临床意义。采用shRNA 技术沉默其表达后，实验组细胞生长受限，体外增殖、侵袭与转移能力下调，体内生长与转移能力随之下降，说明其可能成为宫颈癌临床治疗的潜在靶点。

宫颈癌病情进展是一个多基因参与调控的多分子共同作用的多阶段缓慢过程，致癌因子刺激下，患者宫颈鳞状上皮细胞异常增殖及激活参与分化，形成不典型增生宫颈上皮（原位癌），多种基因协同作用推动病情发展，逐渐演化为鳞状上皮内病变、浸润癌，向淋巴、结肠等靶向器官发生恶性转移，危及患者生命［12］。MCT1 是肿瘤细胞进行糖酵解获取能量的重要介导因子。研究显示，MCT1 在神经胶质瘤、结肠癌、胃癌等肿瘤组织中表达升高，且其表达与患者预后关系密切［13］。LOGOTHETI等［14］研究显示，在膀胱癌中抑制MCT1 表达能明显抑制肿瘤细胞代谢重编程，抑制癌细胞生长。AL-MOUSAWI 等［15］研究报道，在结肠癌细胞HT-29 中下调MCT1 表达能明显减少肿瘤细胞侵袭和恶性转移过程中所需能量。本研究在GENEMANIA数据库中发现CD147 与MCT1 存在特异性调控位点，细胞实验显示，沉默CD147 表达，实验组细胞MCT1 表达明显降低。

综上，宫颈癌组织中CD147 表达升高，抑制CD147 表达能明显下调肿瘤细胞体外和体内增殖、侵袭和转移能力。但能否将CD147 制成特异性探针用于诊断宫颈癌病情进展仍需深入研究。