子宫内膜癌中SFRP4和miR-421的表达与意义

高 美，陈 茜，王 颖(西安交通大学第二附属医院妇产科，西安 710000；
通讯作者，E-mail:mei870601@126.com)

子宫内膜癌(endometrial cancer， EC)是妇科临床工作中常见的一类恶性肿瘤，发病率逐年增高[1]。由于子宫内膜癌发生早期多伴有明显症状(不规则阴道流血)，因此容易较早确诊。病变早期时接受手术治疗一般预后较好，而晚期则需要接受放化疗或内分泌治疗，预后差[2]。具体方案的选择需要根据病理分期来决定。目前子宫内膜癌的发病原因尚不清楚，其发生、发展(远处转移)、复发等过程受基因位点突变、雌激素、代谢水平等的影响，是一个复杂的生物学过程。既往研究证实，microRNAs作为肿瘤促进/抑制因子，通过转录后调控某些关键基因的表达参与肿瘤的形成[3]。其中，miR-421具有促癌作用，在前列腺癌、肺癌、骨肉瘤等组织中其表达水平均增高[4-6]，然而它在子宫内膜癌中的作用尚不清楚。SFRP4可竞争性结合Wnt受体，阻断Wnt信号通路，抑制肿瘤的发生发展[7]。但是有关SFRP4在子宫内膜癌中作用的报道较少。因此，本研究综合利用生物信息学和分子生物学技术，探索性地研究SFRP4表达与子宫内膜癌细胞增殖、患者预后的关系，进而明确miR-421是否参与靶向调控SFRP4表达而影响子宫内膜癌细胞的增殖能力，为明确子宫内膜癌的发病机制、寻找新的干预靶点提供依据。

1.1 材料与数据库

子宫内膜癌细胞系HEC-1A购自上海细胞库；
DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；
miR-421和SFRP4的引物由上海生工合成；
miR-421类似物(mimic)、miR-421抑制剂(inhibitor)、阴性对照miR-NC及过表达质粒(pcDNA-SFRP4)由上海吉玛公司构建；
转染试剂Lipofectamine 2000和RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；
mRNA和microRNA反转录试剂，以及实时定量PCR试剂(TB Green Premix)购自日本TaKaRa公司；
CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。

在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中利用“endometrial cancer”这一关键词进行检索，Series types选择“expression profiling by array”，Organisms选择“homo sapiens”，找到其中的一条记录“GSE106191”(包含64个子宫内膜癌样本和33个子宫内膜良性增生样本信息)，其中良性增生界定为单纯性增生和复杂性增生，不包含不典型性增生，以|logFC|≥1.5，adj.P<0.05为界，通过“Analyze with GEO2R”分析子宫内膜癌组织与良性增生组织的差异表达基因。利用Targetscan在线软件预测可能与SFRP4相结合的microRNA，Gene symbol输入“SFRP4”，Species输入“Human”，得到预测结果。

获取UCSC Xena网站(https://xena.ucsc.edu/)上“GDC TCGA Endometrioid Cancer(UCEC)”数据集中原发肿瘤患者的临床信息(总生存期及肿瘤临床分期)和SFRP4基因表达数据，分析SFRP4表达对子宫内膜癌患者总生存期及肿瘤分级的临床意义。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HEC-1A细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基于37 ℃恒温敷箱(其中CO2浓度为5%)中培养，待细胞密度增长至50%～70%时进行传代和其他处理。

1.2.2 细胞中SFRP4 mRNA和miR-421表达水平的测定 使用TRIzol试剂收集细胞并提取总RNA。具体方法为：溶解细胞的1 ml TRIzol中加入200 μl的三氯甲烷，混匀后静置分层，12 500 r/min离心15 min后取上清，加入等量异丙醇，混匀后静置15 min，再次离心(12 000 r/min)10 min后弃上清，留沉淀。加入800 μl的75%乙醇，再次离心得到的沉淀即为总RNA。加入20 μl的DEPC水溶解RNA，并在核酸蛋白检测仪上测定其OD值，确保OD260/OD280的值在1.9～2.1之间。然后分别使用mRNA反转录试剂和microRNA反转录试剂对提取得到的RNA进行反转录，具体操作遵循试剂说明书。cDNA中按比例加入适量引物、TB Green和ROX dye Ⅱ，并进行扩增。反应条件为: 95 ℃，30 s；
95 ℃，5 s；
60 ℃，30 s，进行40个循环。分别以Actb和U6为内参，计算相应mRNA和microRNA的表达变化情况(2-ΔΔCt法)。引物的具体序列见表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.3 细胞转染与细胞活力检测 将HEC-1A细胞按照每孔1×104的密度种于96孔板(培养基)上生长。待密度达到60%～70%时，按Lipofectamine 2000的用法说明，分别转染miR-421类似物(miR-421 mimics组)、miR-421抑制剂(miR-421 inhibitor组)和阴性对照试剂(miR-NC组)，转染24，48，72 h后，加入10 μl的CCK-8溶液，于37 ℃继续孵育4 h，然后利用酶标仪测量450 nm处的吸光度以间接评估细胞活力。

类似地，将HEC-1A细胞分为4组，待细胞密度达到60%～70%时，用Lipofectamine 2000分别转染阴性对照试剂(miR-NC组)、miR-421类似物(miR-421 mimics组)、miR-421类似物和阴性对照质粒(miR-421 mimics+vector组)、miR-421类似物和过表达质粒(miR-421 mimics+pcDNA-SFRP4)，在转染24，48，72 h后，加入10 μl的CCK-8溶液，于37 ℃继续孵育4 h，然后利用酶标仪测量450 nm处的吸光度以间接评估细胞活力。

1.3 统计学分析

本研究中涉及的计量资料经检验符合正态分布，数据以均数±标准差表示。使用SPSS 20.0软件对数据进行分析。计量资料经检验满足方差齐性的要求，因此两组间的比较采用非配对Student’st检验(two-tailed)，多组之间的比较采用单因素方差分析，并用Tukey’s多重比较做两两之间的差异分析。

计数资料采用卡方检验。生存分析采用Log rank检验、Kaplan-Meier生存曲线模型。使用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 SFRP4基因在子宫内膜癌中表达降低

通过microarray分析，发现了5个差异表达基因，分别是：SFRP4、OGN、OSR2、PEG3和IGF1，其中SFRP4的差异表达变化倍数最大(见图1和表2)。结果显示，SFRP4的表达在子宫内膜癌中明显降低(8.27±0.45vs5.87±0.31，P<0.000 1，见图2)。

图1 子宫内膜癌和子宫内膜良性增生样本间的差异表达基因Figure 1 Differentially expressed genes between endometrial cancer and benign hyperplasia

与良性增生组织相比，****P<0.000 1图2 SFRP4基因在子宫内膜癌和子宫内膜良性增生样本中的表达Figure 2 The gene expression of SFRP4 in endometrial cancer and benign hyperplasia

表2 子宫内膜癌和子宫内膜良性增生样本间的差异表达基因Table 2 The differentially expressed genes between endometrial cancer and benign hyperplasia

2.2 SFRP4基因表达影响子宫内膜癌患者总生存期

以UCSC Xena数据库中543例原发性子宫内膜癌患者的临床资料和测序数据进行分析，发现SFRP4低表达(后1/3)组的总生存期较SFRP4高表达(前1/3)组显著降低(P<0.01，见图3)。而SFRP4的表达水平在肿瘤不同临床分期中无统计学差异(P>0.05，见表3)。

图3 SFRP4表达对子宫内膜癌患者总生存期的影响Figure 3 Effect of SFRP4 expression on overall survival of EC patients

表3 子宫内膜癌组织中SFRP4表达与肿瘤临床分期间的关系Table 3 Relationship between SFRP4 expression in EC tissues and clinical stages

2.3 miR-421靶向作用于SFRP4，降低其表达水平

使用Targetscan软件预测可能作用于SFRP4的microRNAs，结果显示，SFRP4 mRNA的3′-UTR中含有与miR-421相互补的核苷酸序列(见图4)。HEC-1A细胞转染miR-421类似物和miR-421抑制剂后，miR-421的表达水平分别明显增高和降低(P<0.000 1，见图5)。RT-PCR结果显示，与miR-NC组相比，miR-421类似物组SFRP4 mRNA水平显著降低(P<0.01)，相反地，miR-421抑制剂组SFRP4 mRNA水平明显增高(P<0.001，见图6)。

图4 SFRP4和miR-421的结合位点预测Figure 4 Prediction of binding sites between SFRP4 and miR-421

与miR-NC组相比，****P<0.000 1图5 miR-421类似物、抑制剂对HEC-1A细胞中miR-421表达水平的影响Figure 5 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on miR-421 expression in HEC-1A cells

与miR-NC组相比，**P<0.01，***P<0.001图6 miR-421类似物、抑制剂对HEC-1A细胞中SFRP4 mRNA表达水平的影响Figure 6 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on SFRP4 mRNA expression in HEC-1A cells

2.4 miR-421促进HEC-1A细胞的增殖

与miR-NC组相比，转染miR-421类似物后，HEC-1A细胞在24，48，72 h时的增殖能力明显增强，相反地，转染miR-421抑制剂后，HEC-1A细胞在上述检测时间点的增殖能力显著减弱，差异有统计学意义(P<0.05，见图7)。

与同时点miR-NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001图7 miR-421类似物、抑制剂对HEC-1A细胞增殖的影响Figure 7 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on HEC-1A cell proliferation

2.5 SFRP4蛋白过表达可有效回转miR-421对HEC-1A细胞的促增殖作用

尽管转染miR-421类似物后，HEC-1A细胞在24，48，72 h时的增殖能力较miR-NC组明显增强，然而，与miR-421+vector组相比，miR-421+pcDNA-SFRP4组HEC-1A细胞在24，48，72 h时的增殖能力显著降低(P<0.05，见图8)。

与同时点的miR-NC组相比，*P<0.05；
与同时点的miR-421 mimics+vector组相比，#P<0.05，##P<0.01图8 过表达SFRP4蛋白对HEC-1A细胞增殖的影响Figure 8 Effect of SFRP4 overexpression on HEC-1A cell proliferation

近年来，子宫内膜癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，然而其发病机制尚不清楚。寻找新的干预靶点，研发新型化疗药物无疑是值得探索的一种思路。本研究利用生物信息学和细胞生物学技术初步探索了子宫内膜癌的发病机制，创新性地提出了miR-421和SFRP4两个潜在治疗靶点，具有重要意义。

研究表明，microRNAs在各类型肿瘤中通过转录后调控靶基因，发挥抑癌或促癌作用，其表达水平变化与肿瘤发生、发展(扩散或转移)及结局密切相关。其中，miR-421在前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌等众多癌症中表达水平增高，对肿瘤细胞增殖性、侵袭性、化疗药物抗性能力起到关键调控作用[8-10]。尽管多项研究证实了miR-421是一种促癌因子，然而它在子宫内膜癌中的作用却鲜有报道。本研究结果显示，在离体培养的HEC-1A细胞系中，转染miR-421类似物显著促进了子宫内膜癌细胞的增殖水平；
相反地，转染miR-421抑制剂则抑制了肿瘤细胞的增殖，提示miR-421在子宫内膜癌中可能发挥促癌作用。

分泌型卷曲相关蛋白(SFRPs)包含5种分泌型糖蛋白，分别为SFRP1，SFRP2，SFRP3，SFRP4和SFRP5，其结构上包含1个富含半胱氨酸的卷曲相关结构域和1个netrin模块[11]。研究表明，SFRPs通过抑制Wnt/β-catenin信号转导通路，发挥抑癌作用[12]。其中，SFRP4是Wnt的拮抗剂，能够通过结合Wnt受体和frizzled受体，阻断其信号通路。一项研究表明，SFRP4介导乳腺癌干细胞的凋亡，抑制癌细胞的增殖、转移和上皮-间质转化[13]。Wu等[14]的研究也发现乳腺癌患者的SFRP4表达水平较正常人明显降低。在本研究中，通过对GEO数据库中1例基因芯片结果分析，发现子宫内膜癌组织中SFRP4的表达水平较良性增生组织明显降低，与上述研究结果一致。此外，差异基因分析结果提示OGN、OSR2、PEG3和IGF1的表达在子宫内膜癌中也明显降低。赵萌等[15]发现PEG3蛋白在高、中、低分化子宫内膜癌组织中的表达较正常子宫内膜组织明显降低，与芯片结果一致，侧面印证了数据的可靠性。通过对SFRP4表达水平与患者肿瘤临床分期及总生存期的分析发现，SFRP4表达水平低者总生存期显著降低，而与肿瘤临床分期无明确关系，因此SFRP4表达量可作为评价子宫内膜癌患者预后的重要指标。

microRNAs作为一类功能性非编码RNA，通过靶向结合特定mRNA的3′-非翻译区(UTR)，促进其降解，发挥转录后调控基因表达的生物学功能。在本研究中，利用Targetscan软件预测到miR-421可靶向结合SFRP4 mRNA 3′-UTR处24～51位的部分碱基。进一步通过在HEC-1A细胞中分别转染miR-421类似物和miR-421抑制剂，结果发现miR-421可以抑制SFRP4 mRNA的表达。为进一步证实miR-421是通过靶向调节SFRP4表达来影响肿瘤细胞的增殖能力，我们在转染miR-421类似物的细胞中分别转染空质粒和SFRP4过表达质粒，再次观察肿瘤细胞的增殖能力，结果发现，转染SFRP4过表达质粒后，miR-421促肿瘤细胞增殖的作用明显减弱，说明SFRP4可能是miR-421促子宫内膜癌细胞增殖的重要分子机制。

尽管本研究在细胞层面进行了初步验证，然而实验采用的方法比较简单，证据相对单一，关于miR-421靶向抑制SFRP4，促进子宫内膜癌发生发展的科学猜想尚需进一步的功能学验证。下一步我们计划开展划痕实验、Transwell实验等进一步探究miR-421和SFRP4对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响，随后利用SFRP4敲除和高表达的转基因小鼠模型开展荷瘤实验，在动物层面验证miR-421和SFRP4对子宫内膜癌发生发展的影响。

综上所述，miR-421靶向抑制SFRP4的表达，是其促子宫内膜癌细胞增殖作用的重要分子基础，本研究的结果将为以后子宫内膜癌的诊治及药物研发提供新的思路和理论依据。