肿瘤的免疫检查点抑制剂治疗及其标志物概述

杜艳芸，赵紫艳，王晨辉

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院 a.人类疾病基因研究四川省重点实验室，b.中国医学科学院院外创新单元“常见致盲眼病研究及防治创新单元”,四川 成都 610072；
2.电子科技大学医学院，四川 成都 611731)

1.1 细胞毒性T淋巴细胞抗原 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4)分子及其抑制剂的临床应用CTLA-4又称CD152，是免疫球蛋白超家族的成员，主要表达在调节性T细胞(T regulatory cells, Treg)细胞或活化的T细胞上[1]。CTLA-4与CD28分子具有高度同源性。这两个分子可与抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APC)上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)结合[1]。但是CTLA-4在T细胞激活方面发挥着与CD28相反的作用：其通过多种途径抑制T细胞的活化[1]。众多研究表明，CTLA-4基因的多态性可增加如多发性硬化症、类风湿性关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病的易感性[2]，说明CTLA-4在调节免疫系统的平衡和稳态方面发挥着至关重要的作用。

CTLA-4抗体抑制剂是首个被批准的免疫检查点抑制剂，它也是首个不针对肿瘤本身，而是旨在恢复和增强患者抗肿瘤免疫防御，以杀伤和清除肿瘤的药物，对于癌症的治疗具有重大的意义。百时美施贵宝公司的CTLA-4单抗伊匹单抗(Ipilimumab)是首个FDA获批上市的免疫检查点抑制剂药物，用于治疗晚期黑色素瘤[3]。在临床上伊匹单抗常与其他药物联合使用，例如伊匹单抗与PD-1单克隆抗体抑制剂纳武单抗(Nivolumab)联合被用于治疗晚期肾细胞癌、转移性结直肠癌、非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤等[3]。然而，CTLA-4作为T细胞的负调控因子，抑制免疫应答，对于防止自身免疫性疾病的发生至关重要。利用伊匹单抗阻断CTLA-4会造成多部位的免疫相关不良事件，这说明CTLA-4对于机体的免疫耐受十分重要。2022年，FDA批准CTLA-4单抗抑制剂替西木单抗(Tremelimumab)与PD-L1抗体抑制剂度伐利尤单抗(Durvalumab)联合用于治疗肝细胞癌。2022年，由我国康方生物公司自主研发的PD-1/CTLA-4双特异性肿瘤免疫治疗药物——开坦尼被FDA批准上市，用于治疗既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌。

1.2 程序性死亡蛋白1(Programmed cell death protein 1，PD-1)/程序性细胞死亡蛋白-1配体(programmed cell death protein-1 ligand，PD-L1)分子及其抑制剂PD-1又称CD279，是免疫球蛋白超家族的成员，主要在免疫细胞上表达，如巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞[4]。在肿瘤微环境中，活化的T细胞上调PD-1的表达，而PD-1与其配体PD-L1结合会降低IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的分泌，抑制T细胞的增殖，激活T细胞程序性死亡因子的表达，促使T细胞凋亡，从而抑制免疫应答[4]。PD-L1又称CD274，是B7家族的成员之一，广泛表达在多种类型细胞上，包括肿瘤细胞[5]。PD-L1的上调能够抑制免疫系统的过度激活，从而维持机体的自身免疫耐受。肿瘤细胞利用了PD-1/PD-L1抑制免疫系统，发生免疫逃逸。因此，阻断PD-1和PD-L1的相互作用可以逆转免疫抑制状态，提高机体的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力[5]。

最早被FDA批准的PD-1抑制剂是百时美施贵宝公司的纳武单抗(Nivolumab)和默沙东公司的派姆单抗(Pembrolizumab)，均为抗PD-1单克隆抗体抑制剂。纳武单抗又称Opdivo，在临床上被用于治疗黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌[6]。派姆单抗又称Keytruda，用于多发性实体瘤、经典型霍奇金淋巴瘤和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤的治疗。已有研究表明，在III/IV期的黑色素瘤中，派姆单抗治疗在无进展生存期、总生存率和安全性方面优于CTLA-4抑制剂伊匹单抗。除用作单一药物外，派姆单抗还可与化疗药物联用，延长晚期食道癌患者的总生存率[7]。派姆单抗与PARP抑制剂Neriparib联合可用于治疗对铂类耐药的卵巢癌和对一线治疗耐药的三阴性乳腺癌的治疗。再生元公司研制的西米普利单抗(Cemiplimab,Libtayo)也获得FDA的批准，用于治疗转移性/局部晚期皮肤鳞状细胞癌。被FDA批准的PD-L1单抗包括：罗氏公司的阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿斯利康公司的度伐利尤单抗(Durvalumab)和辉瑞公司的阿维单抗(Avelumab)，用于恶性黑色素瘤的治疗。PD-L1抑制剂相比PD-1抑制剂副作用小，而疗效与PD-1抑制剂相当。

1.3 淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)分子及其抑制剂LAG-3又称CD223，主要在CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞和Treg细胞上表达[8]。LAG-3与主要组织相容性复合体II(MHC II)结合，其与MHC II亲和力比CD4高。除此之外，LAG-3还有其他的配体，如半乳糖凝集素、肝窦内皮细胞凝集素和纤维蛋白原样蛋白1。LAG3通过加速T细胞耗竭和抑制T细胞增殖，从而抑制抗肿瘤免疫的发生[8]。2022年，LAG-3单抗抑制剂Relatlimab与PD-1单抗纳武单抗的混合试剂Opdualag获得 FDA批准，用于治疗难治复发型黑色素瘤。虽然目前只获批了一款LAG-3抑制剂，但已有多款LAG-3抑制剂进入临床研究，如MK-4280A、Tebotelimab、Chlorogenic acid、LAG-525等。

1.4 T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白 3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)分子及其抑制剂TIM-3是TIM家族的成员，属于I 型跨膜糖蛋白，表达在终末分化的 CD4+T 细胞亚群(Th1、Th17、Treg)、CD8+T 细胞亚群(Tc1)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和单核细胞上[9]。据报道，TIM3与其配体半乳糖凝集素9结合，抑制Th1介导的免疫应答并诱导T细胞凋亡。另外，TIM-3还有其它的配体，如磷脂酰丝氨酸，癌胚抗原相关细胞黏附分子1和高迁移率组蛋白B1。TIM-3可作为T细胞耗竭的标志物。通过药物靶向TIM-3能够重新恢复T细胞的活力，从而促进T细胞对肿瘤的杀伤。TIM-3是目前研究最多的免疫治疗的靶点之一，但国内外至今还没有上市药物。针对TIM-3的靶向药物目前都处于临床试验阶段。诺华公司的Sabatolimab(MBG453)、葛兰素史克公司的Cobolimab (TSR-022)处于3期临床阶段。罗氏公司的RO7121661、阿斯利康公司的AZD7789等处于临床II期试验阶段。

1.5 T细胞免疫球蛋白和 ITIM 结构域(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)TIGIT分子及其抑制剂TIGIT是免疫球蛋白超家族的成员，主要在自然杀伤细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和Treg细胞上表达[10]，并且在多种恶性肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞中表达上调，如黑色素瘤、急性髓系白血病和非小细胞肺癌等。CD155 (PVR)、 CD112 (PVRL2)和CD113 (PVRL3)是TIGIT的三个配体。TIGIT通过与CD226(T细胞激活受体)竞争结合配体，抑制T细胞的应答。有研究表明[11]，与野生型小鼠相比，TIGIT-/-小鼠接种的B16F10和MC38皮下肿瘤的生长显著减小，在VK*MYC骨髓瘤模型中，TIGIT-/-小鼠存活率增加，并且用TIGIT单抗阻断可延长小鼠存活期。此外，TIGIT单抗可以增强多发性骨髓瘤患者CD8+T细胞的杀肿瘤能力[12]。TIGIT是新型的免疫检查点，但目前尚无针对TIGIT的抑制剂获批上市，针对TIGIT的靶向药物都处于临床试验阶段。百济神州公司的TIGIT抑制剂Ociperlimab已进入Ⅲ期临床试验，拟用于治疗转移性非小细胞肺癌。此外，康方生物公司的AK-127、复宏汉霖公司的HLX-301、阿斯利康公司的AZD-2936、默克公司的M-6223等TIGIT抑制剂正在开展Ⅱ期临床试验。

1.6 其他在研的免疫检查点分子及其抑制剂除了上述提到的免疫检查点分子及研发的相应抑制剂药物，还存在一些其它的潜在检查点分子，如B7-H3、B7-H4、BTNL2等，也被肿瘤细胞利用来逃避免疫系统的识别和杀伤[13，14]。其中针对B7-H3和B7-H4的抑制剂Enoblituzumab和FPA150也已经进入临床试验阶段，并取得了令人鼓舞的初步结果。针对BTNL2分子的临床前研究也表明，这是一个有前景的免疫检查点靶标。期待未来更多的免疫检查点抑制剂可以真正应用到临床，造福患者。

2.1 PD-L1的表达水平PD-L1是PD-1的配体，通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测肿瘤组织以及肿瘤中浸润的免疫细胞上PD-L1的表达水平作为预测免疫检查点抑制剂治疗的疗效已得到广泛认可。多个临床试验结果显示，PD-L1表达水平与PD-1抗体抑制剂治疗患者总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)显著相关[15]。其中，在派姆单抗(Pembrolizumab)用于非小细胞肺癌治疗的临床试验结果显示，无论之前是否接受过其它治疗，对于肿瘤组织中PD-L1膜表达的肿瘤细胞占比大于50%的肿瘤患者，其OS、PFS和客观缓解率(ORR)相对于PD-L1阴性表达的患者均显著增高和延长。在度伐利尤单抗(Durvalumab)用于晚期尿路上皮膀胱癌患者治疗的临床试验中发现，将肿瘤活检样本中PD-L1膜表达(包括肿瘤细胞和肿瘤浸润的免疫细胞)大于25%定义为PD-L1阳性时，PD-L1阳性组的ORR为46.4%，而PD-L1阴性组ORR为0%。鉴于已有的临床试验结果，美国食品药物监督管理局已经批准了几种与PD-L1配套的IHC检测试剂，包括用于派姆单抗疗效评判PD-L1的IHC 22C3 PharmDx；
用于纳武单抗(Nivolumab)疗效评判PD-L1的 IHC 28-8 PharmDx；
用于阿特朱单抗(Atezolizumab)疗效评判的Ventana PD-L1(SP142)和用于度伐利尤单抗疗效评判的Ventana PD-L1(SP263)。虽然PD-L1的表达已经成为一些免疫检查点抑制剂使用的评判标准，但是PD-L1仍然是一个不完善的生物标志物。研究发现不少呈PD-L1阴性肿瘤组织的癌症病例对 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗也有响应[16]。例如，对4174名不同肿瘤类型的随机试验患者进行分析发现，与传统疗法相比，免疫检查点抑制剂治疗显著降低了死亡风险。其中PD-L1阳性表达患者的死亡风险降低了34%，而PD-L1阴性表达患者的死亡风险也降低了20%[17]。造成这种现象的原因较为复杂，一方面是由于PD-L1免疫组化检测的获批试剂对应药物各有不同，并且PD-L1 表达的评估标准也不一致；
另一方面是由于肿瘤组织中PD-L1的表达存在空间和时间的异质性。因此，未来需要通过进一步研究来优化以PD-L1表达水平作为免疫检查点抑制剂治疗肿瘤疗效的生物标志物的标准。

2.2 错配修复缺陷和微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)MSI 是指与正常组织相比，肿瘤中的微卫星位点由于重复单元的插入或缺失而出现新的微卫星等位基因的现象。MSI的发生是由于肿瘤组织的DNA错配修复功能出现缺陷所导致，通常认为DNA错配修复缺陷(Mismatch repair deficiency，dMMR)与高度微卫星不稳定(MSI-H)在生物学上具有一致性。2017年美国食品和药物管理局(FDA)批准派姆单抗用于治疗MSI-H/dMMR实体瘤患者，这是第一种仅基于生物标志物而不考虑肿瘤发生部位获准的药物。FDA批准的依据是基于5项相互独立的临床试验(KEYNOTE016、KEYNOTE164、KEYNOTE012、KEYNOTE228和KEYNOTE158)中记录的149例MSI-H/dMMR癌症患者接受PD-1抑制剂治疗的数据[18]。这149例不同肿瘤类型患者的ORR为39.6%，完全缓解率为7%。反应持续时间为1.6～22.7个月，并且78%的反应持续时间大于6个月。其中2015年进行的KEYNOTE016临床试验评估了派姆单抗在dMMR和错配修复功能完整(pMMR)的结直肠癌患者以及dMMR的非结直肠癌患者中疗效。结果显示，在20周时，dMMR结直肠癌患者和其他dMMR非结直肠癌患者的ORR分别为40% (4/10)和71% (5/7)，无进展生存率分别为78%和67%；
而pMMR的结直肠癌患者ORR为0%，无进展生存率仅为11%[18]。另外，也有临床研究评估了纳武单抗在MSI-H/ dMMR肿瘤患者中的疗效。在一项II期临床试验中发现，74例转移性的MSI-H/dMMR 结直肠癌患者对纳武单抗的ORR为31.1%，12个月的无进展生存率和总生存率分别为50.4%和73.4%[19]。同一研究组还进行了纳武单抗和伊普利单抗联合治疗119例之前接受过治疗的MSI-H/dMMR 结直肠癌患者的研究。结果发现，患者的ORR为55%，12个月的PFS和OS率分别为71%和85%[19]。根据这些研究数据，FDA批准了纳武单抗用于治疗成人和儿童(年龄≥12岁)使用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后出现进展的MSI-H/dMMR结直肠癌患者。虽然MSI-H是预测肿瘤患者是否能受益于免疫检查点抑制剂治疗的一个较为准确的生物标志物，但是具有较高MSI-H发生率的肿瘤类型比较少，因此能够通过该标志物预测获益的患者也相对较少。

2.3 肿瘤突变负荷(tumor mutational burden，TMB)TMB是衡量癌症中基因突变数量的指标。TMB越高，产生肿瘤新抗原的数量也就越多，进而被免疫系统识别的可能性就越大。自从TMB首次被认为是黑色素瘤免疫检查点抑制剂疗效的潜在生物标志物以来，越来越多的研究报道较高的TMB与免疫检查点疗效之间存在密切的关系[20]，说明TMB是一个有潜力的肿瘤免疫治疗疗效预测生物标志物。临床数据分析显示TMB与免疫检查点抑制剂的ORR之间存在显著相关性。在使用免疫检查点抑制剂治疗的151例晚期实体瘤患者中，TMB较低患者的ORR为5%(<5个突变/Mb)，TMB居中患者的ORR为25%(6～19个突变/Mb)，TMB较高患者的ORR为45%(>20～49个突变/Mb)，TMB非常高患者(>50突变/Mb)的患者ORR为65%[20]。目前TMB检测方法主要是基于高通量测序平台的全外显子测序和靶向Panel测序。但检测方法和TMB的评分标准缺乏统一标准。尽管FDA已经批准了派姆单抗在TMB >10突变/Mb的实体瘤中的应用，并且在进一步开发测量血液循环肿瘤DNA的TMB。但作为临床生物标记物，由于测序费用昂贵并且缺乏通用的评分标准，使得TMB的进一步开发和在临床中的广泛应用仍然面临诸多挑战。

2.4 肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤浸润淋巴细胞指浸润在肿瘤微环境中的淋巴细胞，是机体参与抗肿瘤免疫应答的重要组成部分。肿瘤组织中浸润的淋巴细胞丰度与免疫检查点抑制剂的疗效具有显著相关性。通常认为，肿瘤中浸润淋巴细胞越多，免疫治疗效果越好[21，22]。在一项对46例转移性黑色素瘤患者使用派姆单抗治疗的临床试验中[23]，研究人员获取了患者经派姆单抗治疗前和治疗后的肿瘤样本。通过定量免疫组织化学和定量多重免疫荧光分析发现，对抗体治疗有响应的患者肿瘤内CD8+T细胞表现出明显的增殖，并且应答患者在抗体治疗前样本的肿瘤侵袭边缘和肿瘤内部的CD8+T、PD-1+和PD-L1+T细胞显著高于无应答患者。研究者在对接受派姆单抗/纳武单抗治疗的黑色素瘤患者中的研究也得到了类似的结果，即应答者抗体治疗后的活检样本与治疗前的样本相比，肿瘤内CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞数量显著增加[23]。另一研究团队也发现转移性黑色素瘤患者肿瘤中浸润的PD-1hiCTLA-4hiCD8+T细胞比例的增加与抗体治疗应答以及无进展生存期密切相关[24]。因此，肿瘤浸润淋巴细胞也是筛选肿瘤免疫治疗有效人群的一个较为准确的生物标志物。

肿瘤免疫治疗的出现，引领了癌症治疗的重大变革，是晚期肿瘤患者重要的治疗选择之一。除了免疫检查点单药的使用，越来越多的临床研究聚焦于免疫联合治疗，包括不同免疫检查点抑制剂的联合，免疫检查点抑制剂于放疗、化疗、靶向治疗的联合治疗等。但是，目前用于预测肿瘤免疫治疗疗效的生物标志物，如PD-L1的表达水平、TMB、MSI-H对于免疫检查点抑制剂的疗效预测均有限，无法完全准确的预测治疗效果。因此，未来还需要发现新的更为准确的免疫检查点抑制剂疗效预测的生物标志物。或者对多种生物标志物探索联合应用，从而提高预测的准确率。另外，已有的生物标志物在免疫单药使用中具有一定的预测疗效作用，但在联合治疗中的预测价值还存在争议。未来还需要通过大量的基础和临床研究来探索并验证多种组合型生物标志物对免疫检查点抑制剂疗效的预测，特别是对联合治疗疗效的预测，从而真正实现精准的肿瘤免疫治疗。