阿托伐他汀诱导Nrf2缓解非酒精性脂肪性肝病大鼠肝变性

闵方圆，覃鸿恩，肖 慧，周 辉，马云飞 (.恩施土家族苗族自治州中心医院药剂科，湖北 恩施 445000；
.湖北民族大学附属民大医院药剂科，湖北 恩施 445000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)作为代谢综合征的肝表现，近年来患病率呈上升趋势[1-2]。肝内脂质的堆积是NAFLD发生的始动因素[3]。研究认为脂质过氧化及氧化应激反应是NAFLD进程中肝损伤的重要机制[4]。核因子相关因子2(nuclear factor E2 related factors,Nrf-2)信号通路是近年来研究的热点信号通路之一，其活化能促进机体产生多种抗氧化酶，有助于抑制活性氧所致的氧化应激反应[5]。阿托伐他汀作为经典的调血脂药物，在NAFLD动物模型和患者中能改善血脂和胰岛素抵抗[6-7]，但少有研究探讨其对NAFLD致病机制中氧化应激的作用。本研究通过构建大鼠NAFLD模型，从改善代谢和氧化应激两方面探讨阿托伐他汀对NAFLD肝损伤的保护作用，现报告如下。

1.1 实验动物、主要试剂与仪器

雄性SD大鼠50只，体质量200～230 g，购自湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2015-0018。

阿托伐他汀(纯度≥98%，上海吉至生化科技有限公司)；
兔抗鼠Nrf-2、p-Nrf-2、血红素加氧酶(heme oxygenase，HO-1)、奎宁氧化还原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]、GAPDH抗体(英国Abcam公司)；
HRP标记的羊抗兔IgG二抗(美国CST公司)；
天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒(南京建成)；
全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)；
酶标免疫分析仪(美国Biotek公司)。

1.2 大鼠NAFLD模型制备及分组

1.3 大鼠血生化指标检测

使用全自动血生化分析仪检测血清AST、ALT、TC、TG、HDL、LDL、血糖及空腹血清胰岛素水平，操作按说明书进行。

1.4 大鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px检测

制备肝组织匀浆，4 000 r/min离心15 min，取上清液，利用比色法检测上清液中MDA、SOD和GSH-Px水平，操作按说明书进行。

1.5 大鼠肝组织HE染色和TUNEL染色

取10%福尔马林固定的大鼠肝组织，常规脱水、透明、包埋和4 μm切片。将切片分别按照TUNEL和HE染色步骤染色。封片后分别在光镜下观察肝组织病理改变及细胞凋亡。

1.6 Western blot检测大鼠肝组织相关蛋白表达

采用BCA法对提取蛋白质进行定量后，取50 μg上样在100 V电压条件下经聚丙烯酰胺凝胶电泳50 min，300 mA转膜1 h转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入GAPDH(1∶1 000)、Nrf-2(1∶500)、p-Nrf-2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)一抗，并于4 ℃孵育过夜；
洗膜后加入二抗室温孵育2 h，ECL法显色，Image J软件分析条带灰度值。

1.7 统计学方法

2.1 各组大鼠血糖、肥胖指数、空腹血清胰岛素比较

与对照组比较，模型组大鼠血糖、肥胖指数、空腹血清胰岛素水平显著升高(P<0.05)；
与模型组比较，阿托伐他汀中剂量组、阿托伐他汀高剂量组血糖、肥胖指数、空腹血清胰岛素水平均显著降低(P<0.05)，见图1。

*：与对照组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05图1 各组大鼠血糖、肥胖指数、空腹血清胰岛素水平

2.2 各组大鼠血脂水平比较

与对照组比较，模型组、阿托伐他汀低剂量组、阿托伐他汀中剂量组和阿托伐他汀高剂量组大鼠血清TC、TG和LDL水平均显著升高(P<0.05)，HDL水平显著下降(P<0.05)；
与模型组比较，阿托伐他汀中剂量组、阿托伐他汀高剂量组血清TC、TG和LDL水平均显著降低(P<0.05)，HDL水平显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血脂水平比较

2.3 各组大鼠血清AST、ALT水平比较

与对照组比较，模型组、阿托伐他汀低剂量组、阿托伐他汀中剂量组和阿托伐他汀高剂量组大鼠血清AST、ALT水平均显著升高(P<0.05)；
与模型组比较，阿托伐他汀中剂量组、阿托伐他汀高剂量组血清AST、ALT水平均显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清AST、ALT水平比较

2.4 各组大鼠肝组织病理形态改变及肝细胞凋亡情况

光镜下可见对照组大鼠肝细胞形态、小叶结构正常。而模型组肝小叶内肝细胞呈弥漫性脂肪变性，主要为大泡性脂肪变性，也有部分小泡性脂肪变性，小叶内及汇管区可见炎性细胞浸润。不同剂量阿托伐他汀干预后肝脂肪变性程度明显改善，炎性细胞浸润明显减少。TUNEL染色结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡增多；
与模型组比较，阿托伐他汀呈剂量依赖性减少肝细胞凋亡(图2)。

图2 各组肝组织病理变化及肝细胞凋亡情况(×200)

2.5 阿托伐他汀对NAFLD大鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

与对照组比较，模型组、阿托伐他汀低剂量组、阿托伐他汀中剂量组和阿托伐他汀高剂量组肝组织中MDA水平增加(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平降低(P<0.05)；
与模型组比较，阿托伐他汀中剂量组、阿托伐他汀高剂量组MDA水平降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px水平比较

2.6 阿托伐他汀对NAFLD大鼠Nrf2/HO-1/NQO1信号通路的影响

与对照组比较，模型组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1水平降低(P<0.05)；
与模型组比较，阿托伐他汀中剂量组、阿托伐他汀高剂量组p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1水平显著升高(P<0.05)，见图3。

A：对照组；
B：模型组；
C：阿托伐他汀低剂量组；
D：阿托伐他汀中剂量组；
E：阿托伐他汀高剂量组;*：与对照组比较，P<0.05；
#：与模型组比较，P<0.05图3 各组大鼠肝组织Nrf2/HO-1/NQO1信号通路相关蛋白表达

既往研究认为，肥胖、糖耐量受损和血脂异常与NAFLD相关，并可能在其发病中发挥作用[9-11]。本研究HE和TUNEL染色结果显示，对照组肝组织未见明显病理改变，小叶内无炎性细胞浸润，而模型组肝小叶内见广泛的肝细胞弥漫性脂肪变性，小叶及汇管区内伴有大量炎性细胞浸润，肝细胞凋亡增加，符合NAFLD肝损伤的病理形态[12]。另外，模型组AST、ALT水平较对照组显著增加，由此可见本研究成功建立了高脂诱导的NAFLD模型。

目前“二次打击学说”是被广泛接受的NAFLD发生、发展理论。其中胰岛素抵抗与脂代谢紊乱作为始动因素引起肝脂肪变性的首次打击[13]；
各种因素所致的氧化应激与脂质过氧化损伤，引起肝组织炎症和纤维化的二次打击[14-15]。可见，脂质代谢平衡对减轻肝脂肪变性起到重要作用。阿托伐他汀作为经典的高效调血脂药物在临床应用广泛，但对于其在NAFLD中的作用研究较少。本研究结果显示，阿托伐他汀通过改善脂质代谢和氧化应激对肝脂肪变性具有保护作用。NAFLD被认为是代谢综合征的肝表现，本研究中，高脂饮食大鼠出现体质量增加、高脂血症、胰岛素抵抗以及肝脂肪变性等NAFLD模型的典型表现。而阿托伐他汀治疗可以显著改善高脂饮食引起的肝脂肪变性。此外，阿托伐他汀减少了体质量的增长，降低了血清TC、TG和LDL水平。胰岛素抵抗是肥胖与NAFLD相关的中心环节，而他汀类药物被报道具有改善肝胰岛素敏化的作用[16]。本研究中应用阿托伐他汀显著改善了NAFLD模型大鼠的胰岛素抵抗，提示阿托伐他汀能影响NAFLD发生发展中的关键环节进而发挥治疗作用。

氧化应激与脂质过氧化损伤是NAFLD进展中第二次打击的关键。氧化应激使肝GSH-Px活力降低，导致脂质过氧化产物过度产生，形成恶性循环。有研究发现肝损伤小鼠MDA水平与疾病严重程度密切相关[17]。而SOD与GSH-Px等酶系统能防止机体发生过氧化损伤[18-19]。本研究证实阿托伐他汀能提高机体的抗氧化力，减轻NAFLD大鼠肝损伤。

Nrf-2在机体对抗氧化应激损伤中发挥重要作用[20-23]；
Nrf-2磷酸化激活并与抗氧化反应元件相结合，诱导HO-1、NQO1和GSH-Px表达，对抗各种因素引发的氧化应激损伤[24-25]。Nrf-2缺乏被证实在动物模型中表现为对多种肝疾病易感[26]。Sun等[27]研究中阿托伐他汀通过激活Nrf-2信号通路改善心脏缺血再灌注大鼠的氧化应激损伤。本研究结果显示，激活机体内源性Nrf-2/HO-1/NQO1信号通路可以对抗氧化应激损伤。Nrf-2磷酸化是其活化的关键标志。本研究Western blot结果显示，阿托伐他汀可以明显诱导Nrf-2的磷酸化并上调HO-1、NQO1表达水平，且表现为明显的剂量依赖趋势，因此推测阿托伐他汀可能通过激活Nrf-2/HO-1/NQO1信号通路激活对抗NAFLD大鼠的氧化应激损伤而发挥肝保护作用。

综上所述，阿托伐他汀不仅能改善NAFLD大鼠血脂紊乱，还可通过激活Nrf-2/HO-1/NQO1信号通路，促进下游SOD、GSH-Px等表达，降低MDA水平从而发挥肝保护作用。