UV-B,胁迫提高斜纹夜蛾对绿僵菌的抗性研究

黄圆圆，王明慧，何丽艳，熊泽恩，陈 洁，Shaukat ALI，孟建玉，桑 文*

(1. 华南农业大学植物保护学院 / 生物防治教育部工程研究中心，广东广州 510640；
2. 贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属于鳞翅目夜蛾科 昆虫，在亚洲、欧洲及非洲均有分布，在我国主要分布于长江流域、南方各省以及黄河以北少部分地区。斜纹夜蛾能取食109 科389 种植物，包括葫芦科、蔷薇科、豆科、十字花科蔬菜以及柑橘(Citrus reticulata)等果树[1]。其初孵幼虫常聚集于叶背啃食，3 龄后分散取食植物叶片、嫩茎，也可取食花蕾、花，严重时可将整株植物全食。5～6 龄幼虫进入暴食期，其食量约占整个幼虫期的90%以上[2]。斜纹夜蛾不但直接危害作物，其排泄物还可引起植株腐烂[3]。斜纹夜蛾重发区域的作物减产达80%以上，甚至绝收[4]。

目前，以氯虫苯甲酰胺、虫螨腈、茚虫威、甲维盐·茚虫威、甲维盐·虫螨腈等药剂为核心防治手段的化学防治是控制斜纹夜蛾的主要策略，但杀虫剂的长期大量使用会带来“3R”(病虫抗性、农药残留、病虫再猖獗)问题[5—8]。昆虫病原真菌是一种被广泛使用的生物农药，专一性强，杀虫效果好，是害虫绿色防控技术的重要组成部分。绿僵菌(Metarhizium anisopliae) 用于防治澳洲疫蝗(Chortoicetes terminifera)[9]、云杉八齿小蠹(Ipstypographus)[10]和黑豆蚜虫(Aphis craccivora)[11]，致死率均在70%以上。绿僵菌同时被证实对夜蛾科害虫具有良好的防治效果[12]。莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 的自然感染率达29.83%，在室内条件下，用分离获得的1×108个·mL-1孢子悬浮液侵染草地贪夜蛾3 龄幼虫，7 d 后幼虫死亡率可达100%[13]。

昆虫病原真菌资源丰富，具有寄主范围广、代谢类型复杂、生态友好、不易产生抗性、可扩散传播等诸多优点，但其田间应用效果易受环境影响，难以在防控虫害方面继续发挥优势[14—17]。紫外线对微生物的杀伤主要通过使DNA 分子产生嘧啶二聚体，进而使遗传物质失活，导致微生物失去繁殖能力或死亡[18]。研究表明，紫外光直接照射会导致附着昆虫体壁的昆虫病原真菌孢子萌发率降低，杀虫能力大为减弱[19—20]。

昆虫受到真菌侵染时，体内免疫系统被触发。昆虫主要依靠细胞免疫和体液免疫等先天免疫系统来抵御真菌感染[21]。细胞免疫中，昆虫血液循环系统中自由移动的血细胞构成昆虫免疫的第一道防线[22—23]。血细胞通常会吞噬入侵血浆的微生物，并将其包裹控制[24]。美洲大蠊细胞接种绿僵菌后，血细胞通过吞噬作用形成结节使绿僵菌孢子钝化、不能萌发，或者彻底分解孢子[25]。体液免疫的机制多样化，如黑化反应、血淋巴凝固或抗菌肽的产生[23,26]。体液免疫往往依赖于特定的信号通路，比如果蝇受到真菌感染后被诱导合成抗真菌肽(Drosomycin)和碧蝽金属肽(Metchnikowin)等[27]。除了真菌侵染会引起昆虫的免疫反应，其他物理胁迫也会诱导昆虫的免疫反应[28—29]。例如，紫外线-B(UV-B)胁迫诱导激活桃蚜(Myzus persicae)的抗原加工、呈递、趋化因子信号等[30]。那么，UV-B 能否通过提前激活免疫反应间接抑制昆虫病原真菌杀虫效果呢？

本研究通过筛选出对斜纹夜蛾幼虫具有较高致病力的绿僵菌株系，测定UV-B 照射对斜纹夜蛾幼虫抵抗绿僵菌致病力的影响，随后利用异硫氰酸荧光素(FITC)对绿僵菌进行荧光标记，分析紫外线胁迫下斜纹夜蛾血细胞数量、血细胞吞噬作用、血浆抗真菌活性变化，明确紫外辐射对昆虫抵御病原真菌侵染的间接效应，为绿僵菌田间应用提供理论依据。

1.1 昆虫饲养

斜纹夜蛾从华南农业大学试验田的棉花上采集。按照David 等[31]方法连续多代饲养于华南农业大学教育部生物防治工程研究中心。饲养温度(25±2)℃，相对湿度(80±5)%，光周期(L/D) 16 h/8 h。

1.2 虫生真菌培养和孢子悬液配制

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)分离株SCHX46、SM036 和ZB16 来自华南农业大学教育部生物防治工程研究中心虫生真菌种质资源库。将绿僵菌接种于PDA 平板上，在(26±2) ℃下培养10 d[32]。待菌株充分产孢后，用0.01% Tween-80 去离子水溶液洗脱平板上的真菌分生孢子，用滤纸(Whatman No. 2)筛选后装入无菌小瓶。用显微镜计数，配制1×109分生孢子·mL-1绿僵菌孢子悬浮液，以此为原液，用含0.01% Tween-80 去离子水连续稀释，制备较低浓度(1×105、1×106、1×107和1×108分生孢子·mL-1)分生孢子悬浮液[17]。

1.3 斜纹夜蛾幼虫的绿僵菌处理

用饲喂法比较不同株系、不同浓度绿僵菌分生孢子悬浮液处理对斜纹夜蛾4 龄幼虫死亡率的影响。在未凝固人工饲料中添加5 种浓度(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109分生孢子·mL-1)的各个绿僵菌分离株。以不添加真菌孢子为对照。将制备好的饲料冷却，置于4 ℃备用。将刚蜕皮的斜纹夜蛾4 龄幼虫饥饿3 h 后移入直径4 cm 小塑料杯，分别投喂饲料1 g。每处理设置5 个生物学重复，每重复30 头幼虫，每天更换新鲜饲料。统计处理7 d后幼虫死亡率，选择致死率最好的绿僵菌分离株。利用所选的绿僵菌菌株孢子悬液注射法检测斜纹夜蛾4 龄幼虫死亡率。按照1.2 制备绿僵菌菌株分生孢子悬液(1×103、1×104和1×105分生孢子·mL-1)。将4 龄斜纹夜蛾幼虫静置于冰上5 min 使其休眠，然后用75%乙醇擦拭虫体灭菌。对幼虫腹部进行注射孢子悬液以感染斜纹夜蛾。对照组注射等量的DPBS 溶液。

1.4 UV-B 处理斜纹夜蛾幼虫

将4 龄斜纹夜蛾幼虫置于UV-B 荧光灯(光源波长的峰值在303 nm，TL 20W/12 RS，东莞智臣电子有限公司，中国)下照射0.5 h，以未照射UV-B 的斜纹夜蛾幼虫作为对照。每天记录幼虫死亡率。每处理设置3 个生物学重复，每重复20 头幼虫。

1.5 斜纹夜蛾幼虫血淋巴吞噬能力测定

采用异硫氰酸荧光素(FITC)对绿僵菌进行标记[34]。将4 龄幼虫分为2 组，每组20 头幼虫。紫外线处理幼虫0.5 h，对照组幼虫置于实验室条件下。幼虫孵育后先用75%乙醇擦拭虫体灭菌，再用显微注射器从幼虫腹部气门处注射FITC 标记的孢子悬液(1×107分生孢子·mL-1) 20 μL。注射后对幼虫进行取血，并立即向血淋巴中加入抗凝剂。在暗视野显微镜下观察不同时间点血淋巴中血细胞的吞噬情况，确定吞噬一个或多个分生孢子的血细胞百分比，测定其吞噬率。每样本观察200 个以上血细胞，每处理3 次重复。

1.6 斜纹夜蛾幼虫血浆抗真菌活性测定

用含有100 μg·μL-1氨苄西林的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)稀释绿僵菌分生孢子悬浮液至4×104分生孢子·mL-1。分别在紫外胁迫处理0 h、4 h、8 h及24 h 时将紫外线照射0.5 h 的斜纹夜蛾4 龄幼虫置于冰上5 min，然后解剖并收集血淋巴，以相同时间点未作UV-B 处理的斜纹夜蛾4 龄幼虫为对照。将收集的血淋巴加入DPBS，1/5 稀释，然后测定每毫升血淋巴细胞数。剩余样品离心提取血浆，将血浆置于-80 ℃冰箱保存。

取稀释的绿僵菌孢子悬浮液100 μL分别与不同处理幼虫的100 μL 血浆混合，置于96 孔组织培养板培养24 h 后，混合培养板内溶液，从每个孔中取出50 μL 溶液，用PDB 稀释至100 μL。将溶液涂抹在马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)平板上，在培养箱中培养，10 d 后测定孢子数。每处理3 次重复。

1.7 数据分析

用SPSS 19.0 进行单因素方差分析(one way ANOVA)和多重比较，通过Tukey’s HSD 检验差异显著性(P＜0.05)。采用GrapgPad Prism 8 软件绘图。

2.1 饲喂法筛选绿僵菌毒力菌株

为保证对照组和实验组用金龟子绿僵菌处理的斜纹夜蛾幼虫死亡率有显著差异，先筛选出毒力最强的菌株。用含有不同浓度分生孢子的人工饲料饲喂斜纹夜蛾4 龄幼虫，幼虫死亡率随饲料中孢子浓度升高而升高。比较相同浓度(1×109分生孢子·mL-1)菌株处理斜纹夜蛾5 d 后的死亡率，ZB16、SM036和SCHX46 处理后的死亡率分别为82.22%、73.00%和71.00% (图1)。三种绿僵菌菌株中，ZB16 毒力最强，其次为SM036 和SCHX46。此外，ZB16 菌株的致死速度也较快。因此，后续采用金龟子绿僵菌菌株ZB16 实验。

图1 三种绿僵菌菌株不同浓度孢子悬浮液对斜纹夜蛾幼虫的致死率比较Fig. 1 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to topical application of three different isolates of Metarhizium anisopliae

2.2 不同浓度绿僵菌ZB16 孢子悬浮液对斜纹夜蛾幼虫死亡率的影响

斜纹夜蛾4 龄幼虫的死亡率与绿僵菌分生孢子浓度成正比(图2)。注射1×105分生孢子·mL-1悬浮液7 d 后，幼虫死亡率最高(72.22%)，而注射1×103分生孢子·mL-1悬浮液的幼虫死亡率最低(30.00%)。注射1×104分生孢子·mL-1悬浮液的幼虫死亡率为50%，该剂量用于后续实验。

图2 绿僵菌ZB16 不同孢子浓度悬浮液处理的斜纹夜蛾幼虫死亡率Fig. 2 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to injection of Metarhizium anisopliae isolate ZB16

2.3 UV-B 胁迫对斜纹夜蛾幼虫抗真菌能力的影响

UV-B 照射斜纹夜蛾幼虫0.5 h，然后注射不同浓度绿僵菌分生孢子悬浮液。结果表明，未经UV-B照射的斜纹夜蛾幼虫注射绿僵菌悬浮液(1×104分生孢子·mL-1) 7 d 后存活率为49.67%，而UV-B 照射0.5 h 后再注射绿僵菌悬浮液的斜纹夜蛾幼虫7 d 后存活率为65.56%(图3)。多重比较表明，相同时间内不同处理间幼虫死亡率有显著差异(图3)。

图3 UV-B 胁迫下注射绿僵菌孢子悬浮液的斜纹夜蛾死亡率(%)Fig. 3 Effect of UV-B stress on mortality (%) of Spodoptera litura injected with Metarhizium anisopliae

2.4 UV-B 胁迫对斜纹夜蛾幼虫血淋巴中血细胞数量的影响

UV-B 照射0.5 h 再用绿僵菌处理的斜纹夜蛾4龄幼虫与未照射UV-B 只用绿僵菌处理的幼虫相比，其在不同时间测得血细胞数量均有显著差异。UV-B处理0.5 h 后的4 h、8 h 以及24 h，用绿僵菌处理的斜纹夜蛾幼虫血细胞数量与对照组(未照射UV-B)相比显著增加(表1)。

表1 UV-B 胁迫对幼虫血细胞数量的影响Table 1 Effect of UV-B exposure on the amount of hemocyte of Spodoptera litura larvae

2.5 UV-B 胁迫对斜纹夜蛾幼虫血细胞吞噬功能的影响

UV-B 照射0.5 h 后用绿僵菌处理的斜纹夜蛾4龄幼虫与未照射UV-B 的幼虫相比，两者在不同时间测得的血细胞吞噬率均有显著差异。UV-B 照射组的斜纹夜蛾幼虫血细胞吞噬率在处理4 h 后最高，达30.2%，随后逐渐降低(表2)。

表2 UV-B 照射对斜纹夜蛾幼虫血淋巴中血细胞吞噬活性的影响Table 2 Effect of UV-B exposure on phagocytic activity of Spodoptera litura haemocyte in haemolymph

2.6 UV-B 胁迫对斜纹夜蛾幼虫血浆抗真菌活性的影响

金龟子绿僵菌孢子悬浮液分别与不同时间实验室条件下饲养幼虫的血浆以及UV-B 照射0.5 h 处理后幼虫的血浆混合培养。培养10 d 后，UV-B 处理后4 h 与8 h 的幼虫与实验室条件下饲养的相同时间点的幼虫相比，其血浆与真菌孢子悬浮液混合物中真菌孢子数显著降低。说明紫外胁迫能够增加斜纹夜蛾幼虫血浆的抗真菌活性(表3)。

表3 UV-B 照射对斜纹夜蛾血浆抗真菌活性的影响Table 3 Effect of UV-B exposure on anti-fungal activity in Spodoptera litura plasma

绿僵菌是一种寄主范围较广的昆虫病原真菌，被应用于多种害虫防治[15]。然而，诸多因素可能抑制绿僵菌活性，其防治效果一定程度上取决于自身对这些环境因素的耐受性。太阳辐射中的紫外线成分(UV-A 和UV-B)对生物有机体，包括真菌有破坏作用[36]。UV-B 照射可抑制真菌分生孢子的活性[37—38]。此外，亚致死剂量的紫外线照射不仅降低绿僵菌的萌发率还能降低其毒力[39—40]。绿僵菌这种易受环境干扰的不稳定性是对其应用于田间防治害虫的一种严重阻碍[41—42]。然而，紫外线作为自然环境中广泛存在的物理胁迫因子，不仅对绿僵菌产生直接影响，同时可能通过影响昆虫免疫，如上调昆虫中热激蛋白基因的表达来影响绿僵菌防治效果[43]。因此明确UV-B 对绿僵菌侵染昆虫的影响，有助于提高虫生真菌类生物农药在害虫防治中的应用效果。

本研究发现UV-B 胁迫能使被绿僵菌侵染的斜纹夜蛾死亡率降低。实验中为了排除幼虫死亡是由UV-B 对真菌孢子的直接影响造成的，皆对斜纹夜蛾幼虫先进行UV-B 胁迫，后用绿僵菌处理。有类似的研究表明，物理胁迫能减少虫生真菌对昆虫的侵染。自然感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫，分别在43 ℃和28 ℃饲养15 min。43 ℃下饲养的幼虫存活时间显著更长，且大蜡螟幼虫先受到热胁迫后再注射球孢白僵菌，也有类似表现，说明大蜡螟幼虫存活率增加并非热胁迫对真菌的不利影响造成的[44]。Mowlds 等[45]研究表明，大蜡螟幼虫被白色念珠菌(Monilia albican)感染前在4 ℃或37 ℃下预孵育24 h，与在30 ℃下预孵育24 h 相比，对白色念珠菌的抗性增强。Richards 等[44]的研究表明，热胁迫24～48 h 能在一定程度上减少甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)幼虫受绿僵菌和白僵菌的感染。温和的物理刺激(摇晃)幼虫也可以减少白色念珠菌和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)对大蜡螟幼虫的感染[46—47]。

物理胁迫可以诱导昆虫的免疫反应，进而影响真菌的致病潜力[43—44,48]。甘蓝夜蛾受热胁迫(伴随着真菌感染)后，其血细胞数量增多、血细胞吞噬功能增强，且幼虫血淋巴中某些抗微生物肽的水平增加[44]。有研究表明，血细胞可以吞噬真菌分生孢子，并通过伤口愈合和血凝固保护昆虫免受真菌感染[34,49]。本研究中，紫外胁迫能提高斜纹夜蛾幼虫血细胞数量、血细胞吞噬功能和血淋巴抗真菌活性，并且受紫外胁迫后斜纹夜蛾幼虫的真菌抗性显著提高。说明在绿僵菌侵染昆虫时，UV-B 胁迫下的斜纹夜蛾幼虫免疫反应被激活，从而抵御真菌侵染。

本文从对斜纹夜蛾幼虫具有较高致病力的金龟子绿僵菌3 种株系中筛选出毒力最高的菌株ZB16，研究表明紫外胁迫降低了受绿僵菌侵染的斜纹夜蛾4 龄幼虫的死亡率。进一步利用异硫氰酸荧光素(FITC)对绿僵菌进行荧光标记，证实紫外线胁迫下斜纹夜蛾血细胞数量、细胞吞噬活性以及血浆抗真菌活性均上升，说明紫外线胁迫下的昆虫免疫反应发生变化，对绿僵菌的抗性增强。