基于网络药理学和分子对接技术探讨矢志方治疗尿酸性肾病的作用机制

辛家东，杨可新，周嘉宝，王传旭，高建东

(1. 上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；
2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000)

尿酸性肾病在嘌呤代谢紊乱的情况下，会造成尿酸排泄障碍或者生成过多，引起血尿酸的升高，当尿酸盐在血液中处于过饱和状态时会导致肾脏病变，若没有得到及时治疗，病情会发展恶化至终末期肾衰竭[1]。慢性尿酸性肾病的常规治疗以降尿酸为主，而在本身肾功能受损的情况下会缩小降尿酸药物的选择范围。临床治疗中的降尿酸药物如非布司他、别嘌呤醇等常被认为是肾脏保护剂，但其有可能引起的心血管风险、过敏等不良反应亦不可忽视[2]。因此寻求新的药物是当前迫切解决的问题，而中医药治疗尿酸性肾病的多项研究证明是安全有效的[3]。矢志方是上海中医药大学附属曙光医院通过“活血通络、化痰祛湿”治法总结创立的经验方，由王不留行、车前子、白芥子、冬葵子四味药物组成，临床中治疗尿酸性肾病效果肯定，但具体的作用机制尚未明确。网络药理学为基于“疾病-基因-靶点-药物”交互的网络，通过综合且系统的角度分析药物对疾病的干预和治疗作用，以阐明药物作用于人体的复杂机制[4]，故亦可应用在具有多成分、多靶点、多途径特性的中药里。本研究通过网络药理学的方法对矢志方的活性成分及靶点进行筛选，以探讨其治疗尿酸性肾病的关键活性成分、核心靶点及信号通路。

1.1矢志方药物的获取和筛选 在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集矢志方药物的主要化学成分。生物利用度(oral bioavailability,OB)即口服药物的核心药动学参数，能够体现口服药物剂量在体循环里的比例[5]。类药性(drug-likeness,DL)则是可以定性地分析化合物是否具有与目前已知药物相似的化学和物理性质[6]。本研究以OB≥30%及DL≥0.18为标准对矢志方有效成分及其作用靶点进行筛选。通过Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)选择参数为已验证(reviewed)的人类物种(human)数据库，并将所有靶标名称规范为基因名。

1.2尿酸性肾病相关靶标的获取与矢志方治疗尿酸性肾病靶点的筛选 通过Gene Cards数据库(https://www.Gene Cardsorg/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、PharmGkb数据库(https://www.pharmgkb.org/)检索“Uric acid nephropathy”获取尿酸性肾病的相关靶点，并与矢志方有效成分相对应的药物靶点取交集，以得到矢志方作用于尿酸性肾病的靶点，最终采用Venn图的形式体现交集靶点。

1.3矢志方成分和靶点的网络绘制 将矢志方有效成分信息与尿酸性肾病相关靶标导入Cytoscape 3.8.0软件中以绘制矢志方成分及靶点的网络图。利用插件Cyto NCA分析网络的特性，准确直观地体现中药治疗尿酸性肾病的主要与次要有效成分。

1.4构建药物-疾病靶标蛋白相互作用网络(PPI) 将矢志方与尿酸性肾病交集的81个靶点导入STRING version:11.0数据库(https://string-db.org/)，限定为人类物种(Homo sapiens)，设置minimum required interaction score为highest confidence 0.900，舍弃游离节点，得到蛋白互作信息，利用R软件筛选核心靶点。

1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通过R软件version:4.1.1对矢志方作用于尿酸性肾病的靶蛋白进行生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞成分(cellular component,CC)分析，即基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。设置P<0.05为筛选要求，对排名在前10的不同生物学过程条目进行柱状图绘制。然后利用R软件对基因组百科全书(KEGG)通路采取富集分析，同样设置P<0.05，作为显著富集筛选要求，获取矢志方治疗尿酸性肾病的主要作用通路，并将排名前30的信号通路绘制为柱状图。

1.6分子对接 从Protein Data Bank(https://www.rcsb.org)中下载拓扑分析里排名前6的核心蛋白，JUN(PDB ID:6y3v)、HIF1A(PDB ID:6gmr)、MAPK1(PDB ID:2y9q)、MYC(PDB ID:4y7r)、TP53(PDB ID:1xqh)、RELA(PDB ID:6qhl)的晶体结构。通过软件Chem3D Ultra14.0把从Pub Chem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)里下载的化合物结构转化为三维结构。再运用Py MOL软件，对靶蛋白受体采取脱水和去除小分子配体等处理后，利用Auto Dock Tools 1.5.6对其受体分子进行计算电荷、加氢等处理。然后将靶蛋白受体和化合物转换为“pdbqt”文件，并对盒子中心以及盒子格点参数进行合适的设置。最终运行Vina 1.5.6对分子对接的验证进行评估，并且运行Discovery Studio 2019寻找对接位点并计算柔性结合的LibDockScore，将输出的分子对接结果导入PyMOL软件进行分子对接构象展示。若结合能小于0说明配体与受体可自发结合，当Vina结合能≤-5.0 kcal/mol以及LibDockScore>100说明两者形成稳定对接，对配体-受体复合物进行分子对接结果3D、2D展示，以评价生物信息分析预测的可靠性。

2.1矢志方活性成分的筛选 在TCMS数据库检索矢志方药物全部的化学成分，设定筛选条件分别为OB≥30%，DL≥0.18的化合物，得到符合标准的活性成分共有21个，其中王不留行4个，白芥子3个，车前子9个，冬葵子5个，见表1。

表1 矢志方药物活性成分

2.2矢志方治疗作用靶点的筛选与尿酸性肾病相关靶标的收集 通过TCMSP平台数据库筛选矢志方药物活性成分相应的潜在作用靶点，去重后，共计181个。利用Gene Cards、OMIM、PharmGkb数据库检索“Uric acid nephropathy”获取尿酸性肾病的相关靶点以进行整合，去除重复靶点，共计1132个。利用R软件绘制Venn图(见图1)，显示出矢志方药物治疗尿酸性肾病的交互靶点共计81个(见表2)。

图1 矢志方与尿酸性肾病Venn图

表2 矢志方与尿酸性肾病交互靶点

2.3“中药-活性成分-靶点-疾病”网络的构建及分析 运用Cytoscape软件对中药-活性成分-靶点-疾病关系数据进行网络构建，导入文件后得到相应的网络图(见图2)。药物活性成分与作用靶点两者之间的联系用每条边表示，V型代表药物成分，菱形代表靶点。此网络图中共有94个节点，其中靶点节点有81个，化合物节点有13个。相互作用的边有292条。表明矢志方中有13个有效成分作用于尿酸性肾病的靶点。

图2 中药复方调控网络

2.4PPI网络的构建及分析 在Cytoscape软件中导入STRING获取的数据并构建网络图，利用插件Cyto NCA进行拓扑分析，通过BC、DC、EC、CC、LAC、NC进行二次打分以获取子网络，最终得到6个节点，15条边。这6个靶蛋白有可能是矢志方治疗尿酸性肾病的关键靶蛋白(见图3)。

图3 矢志方治疗尿酸性肾病的PPI网络

2.5GO功能富集分析和KEGG通路分析 利用R软件对矢志方有效作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。基于P<0.05确定2 020个GO条目，其中包含1 862个BP条目，33个CC条目，125个MF条目。其中生物过程(biological process)主要涉及的有对药物的反应、对细胞外刺激的反应、对营养水平的反应、对脂多糖的反应、细胞对化学应激的反应等；
细胞组分(cellular component)涉及的有膜筏、膜微区、转录调节复合体等；
分子功能(molecular function)主要涉及的有DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II-特异性DNA-结合转录因子结合、细胞因子受体结合、泛素样蛋白连接酶结合等，同时分别取排名前10的条目进行柱状图绘制以便可视化分析(见图4)。进行KEGG富集分析，根据P<0.05，结果显示有143条矢志方治疗尿酸性肾病靶点的通路，同时将排名前30条信号通路进行柱状图绘制，涉及的通路有Lipid and atherosclerosis(脂质与动脉粥样硬化)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(AGE-RAGE信号通路)、Fluid shear stress and atherosclerosis(流体剪切应力与动脉粥样硬化)、IL-17 signaling pathway(IL-17信号通路)、TNF signaling pathway(TNF信号通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信号通路)、p53 signaling pathway(P53信号通路)、NF-kappa B signaling pathway(NF-κB信号通路)等(见图5)。

图4 矢志方有效作用靶点GO功能富集分析结果

图5 矢志方有效作用靶点KEGG功能富集分析结果

2.6分子对接 有效活性成分槲皮素与核心蛋白HIF1A、JUN、MYC，木犀草素与MAPK1、TP53，以及异牡荆素与RELA均可以稳定对接，其结合能均低于-5.0 kcal/mol。同时应用Discovery Studio 2019软件对活性分子及对应靶蛋白进行对接分析(详见表3)，可知有效活性成分均能与其各自的核心蛋白HIF1A、JUN、MAPK1、MYC、RELA、TP53的受体-配体进行半柔性对接，结果表明DS均能找到对接位点,除槲皮素与核心蛋白HIF1A-6gmr结构域与槲皮素与MYC-4y7r结构域形成的对接模型LibDockScore小于100外，其余均大于100。由于不同核心蛋白和不同活性分子在不同氨基酸位点会引起不同的氢键及疏水键联系，彼此结果形成不一样的对接体。最后将Vina输出的化合物导入Pymol中并运行Discovery Studio2019软件，进行与蛋白配体3维分子对接(见图6)。

表3 矢志方中有效活性成分分子对接Vina、Discovery Studio 2019结果

A为HIF1A-槲皮素；
B为JUN-槲皮素；
C为MAPK1-木犀草素；
D为MYC-槲皮素；
E为RELA-异牡荆素；
F为TP53-木犀草素图6 矢志方中有效活性成分分子对接3D模型

尿酸性肾病在传统医学中并没有与之相对应的病名，可根据临床表现与发病特点归属于“痛风”“腰痛”“痹症”“虚劳”“水肿”等范畴中[7]。高建东教授认为此病的基本病理因素在于湿浊痰瘀，可严重影响病情发展的转归[8]。矢志方由王不留行、车前子、白芥子、冬葵子组成，本团队运用此方在临床中治疗尿酸性肾病20余年，疗效甚好，矢志方也是上海中医药大学附属曙光医院治疗尿酸性肾病的经验方[9]。本课题组研究发现，矢志方能明显降低高尿酸血症大鼠血尿酸水平，抑制肾小管炎症[10]。为了深入研究矢志方治疗尿酸性肾病的作用机制，本研究利用网络药理学构建“矢志方-活性成分-靶点-疾病”网络，筛选收集治疗尿酸性肾病的核心靶点，并通过GO、KEGG富集分析，最后进行分子对接验证，阐明矢志方治疗尿酸性肾病多靶点、多成分、多通路的特点，提供临床治疗理论依据。

本研究筛选出矢志方与尿酸性肾病交集靶点有81个，构建出“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图后，发现此方治疗疾病的主要活性成分有槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、异牡荆素(isovitexin)等。槲皮素成分广泛存在于中药材中，隶属黄酮类的化合物，能够抑制氧化应激和炎症反应，不仅能够降低尿酸水平还能减轻高尿酸血症对肾脏的危害[11]。人体内产生尿酸的关键酶是黄嘌呤氧化酶(XOD)，研究发现槲皮素能够可逆性抑制XOD催化产生的尿酸以及超氧阴离子自由基(O2-)的生成[12]。木犀草素能够通过促进尿酸排泄和减少尿酸生成两种途径降低尿酸水平，同时可以改善高尿酸血症引起的肾脏损害[13]。异牡荆素具有抗氧化[14]、镇痛消炎[15]的功能。

通过PPI网络图分析得到JUN、HIF1A、MAPK1、MYC、TP53、RELA等关键靶点。在炎症、血管通透性、类风湿性关节炎小鼠模型中发现，JUN是抗炎治疗的有效靶点[16]。多项研究表明氧化应激参与细胞凋亡过程[17]，其中缺氧是引起人体出现氧化应激的重要因素。肾脏对氧化应激具有高度敏感性，会引起多种肾脏固有细胞损伤，进而出现多种肾脏疾病进展、恶化的情况。HIF1A与人体缺血缺氧密切相关，认为在氧化应激的诱导下促进肾小管细胞凋亡[18]。MAPK1作为MAPK的基因成员，是一项重要的炎症评价指标，能够对多种细胞外刺激信号做出反应以介导炎症的发生[19]。TP53可以直接影响人体免疫应答能力，与细胞免疫浸润水平具有密切的关系[20]。RELA是NF-κB家族成员之一，活化后的NF-κB可以快速启动靶基因并加速其转录，在调控基因表达的同时也迅速激活TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、干扰素、趋化因子等致炎因子和诱导NO合成酶的转录[21]。

从KEGG通路富集结果可知，程度最高的AGE-RAGE信号通路与糖尿病发生关系密切，尿酸性肾病与糖尿病均属于代谢障碍的范畴，AGE-RAGE通路在参与氧化应激的过程中激活炎症因子与活性氧的生成，可以出现血管壁的损伤[22]，而多项研究表明尿酸能够介导血管损伤的可能机制，并且均涉及尿酸介导的炎症反应[23]。正常人体中RAGE的表达量极低，当体内产生诸如炎症、糖尿病等病理变化时，会增加其表达量。因此推测矢志方抑制AGE-RAGE通路能够减轻痛风患者血管内皮与肾脏损伤。矢志方可以调控流体剪切应力与动脉粥样硬化，研究表明剪切应力可以改变内皮细胞生理功能引起炎症、动脉粥样硬化与血管功能障碍的发生[24]。IL-17信号通路可以激活NF-κB转录因子，在炎症反应过程中此转录因子具有对细胞黏附因子与细胞因子表达的作用，可激活细胞产生众多炎症因子，进而诱发自身免疫性疾病，同时IL-17通路在这种途径刺激下也提高了自身信号通路里炎症因子的表达[25]。研究发现IL-17中和抗体的应用能够减轻痛风模型动物的组织炎性浸润[26]。除此，TNF信号通路也参与调控了痛风炎症反应[27]。有研究证实，TNF拮抗剂在减轻痛风性关节炎急性炎症反应的同时还能够保证降低尿酸水平[28]。尿酸水平的升高会扰乱促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白之间的平衡而促使肾小管细胞凋亡[29]，在家族性尿酸性肾病患者的肾活检中发现肾小管上皮细胞的凋亡[30]。大量研究表明，HIF-1信号通路可以激活多种下游靶基因表达发挥抑制肾小管上皮细胞损伤的功能，尤其在缺氧应答过程中占有重要地位[31]。有文献表明，P53信号通路具有丰富的动力学表现，能够决定细胞命运，如压力会引起细胞内DNA受损，低表达的P53会引起短暂性细胞周期阻滞，促使细胞修复，而高表达的P53则会导致细胞凋亡[32]。

本研究运用网络药理学与分子对接技术对矢志方治疗尿酸性肾病的成分、靶点、通路之间的相互联系进行探索，推断矢志方可以发挥影响信号传导、炎症反应、代谢等途径的作用，进而能够治疗尿酸性肾病。其机理是利用AGE-RAGE、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17、TNF、NF-κB 等信号通路发挥抗炎、降低尿酸水平、改善代谢功能以治疗尿酸性肾病。然而此研究主要是通过多个信息库的数据进行筛查分析，或许会存在与实际结果不一致的可能性，需要对矢志方治疗尿酸性肾病的作用机制进行更深一步的细胞生物学和动物实验验证，但也为科学研究提供新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。