平板计数法与纸片法检测食品微生物菌落总数的比较分析

◎刘 珂，余 希

（南昌市西湖区疾病预防控制中心，江西 南昌 330009）

菌落总数是指食品在一定条件下经过处理后，所得1 g 或1 mL 检样中所含的细菌菌落总数。菌落总数作为判别食品被污染程度的标志，其目的在于了解食品从原料加工到成品包装受外界污染的情况。在此过程中，无论采取何种方式加工食品，都不可避免地发生微生物污染食品的情况，但只要食品中的微生物含量在合理范围内就不会给人体健康带来威胁。通过采用合理的计数方法确定食品微生物菌落总数，不仅可以提升食品检测结果的准确性，还可以提高食品安全管理水平，对推动食品行业发展有着积极的意义。

平板计数法是指利用琼脂、明胶等凝胶型固体培养基制成一个平面，并在此培养基上培养微生物，若干天后，对已形成菌落数进行统计，得到菌落总数的方法。该方法在具体应用过程中的流程如下：首先，将待测样品适当稀释，其中的微生物充分分散成单个细胞；
然后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养后，每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；
最后，统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。该方法在使用过程中，具有培养结果易于辨认、计数结果准确性较高等优势，但也存在不足，如检测周期较长、受环境影响较大等。纸片检测方法是利用快检纸片代替培养基，利用菌落显色药剂指示菌落总数，从而得到相应的计数结果。其具体操作流程如下：在进行计数实验前，需要确保样品以外所有需要和纸片进行接触的物品，如移液管、烧杯等，都在前期进行无菌化处理。同时，计数实验人员需要佩戴口罩、头套、手套（均经过无菌化处理），方可进行实验，检测人员将纸片从盒中抽出后，利用生理盐水进行浸泡，这样可以确保纸片和样品充分接触，整个过程维持30 s，随后将纸片从样品中取出，并将其放置在37 ℃恒温箱内进行培养，培养18 h 后根据菌落显示进行计数。该方法在使用过程中，由于具有采样过程污染小、携带便捷性强、环境适应性强、结果方便统计等优点受到研究者的青睐。另一方面，该技术在应用中也有一些不足之处，如细菌数量较大时，计数结果不可用，并且检测内容比较固定，一次只能检测一类菌种，具有一定的局限性[1]。

除上述提到的基本概念外，菌落总数的计数基础是每一个细菌在培养基中可以逐渐形成一个能够肉眼观察到的单独菌落。另外，培养菌体需要在有氧环境下进行，部分细菌（如厌氧的乳酸菌、硝化细菌等）在此环境下无法生存，而且一些特殊细菌（如硫化细菌等）在生长过程中需要某些特殊营养物。因此，所统计的数据并不代表样品中实际存活的细菌总数。需要明确的是，在培养基中所得到的细菌数量主要以喜爱中温、有氧型、兼性厌氧的细菌种类为主，而其他类型的菌种，还需要采取其他的处理方式进行检测，从而得到准确的检测数据，提高检测结果的准确性。

现阶段，国内食品微生物检测工作中有关菌落技术检测的要求，主要遵循《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行。该规则主要以平板计数法作为主要检测方法，该方法具有培养结果易于辨认、计数结果准确性较高等优势。但也有一些检测机构将纸片法作为主要检测方法，其参考了《食品中细菌总数的检测再水化干膜法》中的相关内容。纸片法目前主要是在加拿大、美国等地区进行推广，国内对于纸片法的应用尚处于讨论阶段，目前仍是以平板计数法作为主要的检测手段。

2.1 材料与仪器

①平板计数琼脂培养基，校核是否变质，按要求对其进行存储。②3M Petrifilm 菌落总数测试片，校核是否变质，按要求对其进行存储。③质控样品2 份，作为参考组使用。

2.2 实验样液制备

为了对比平板计数法和纸片检测方法的优劣，需要进行相关实验。①质控样品。在无菌环境下打开装有冻干样品的西林瓶，在30 s 内用滴定管（5 mL）吸取4 mL 无菌生理盐水加入西林瓶中，使冻干样品中的粉末充分溶解，随后将混合溶液转移到无菌锥形瓶中，再用剩余的生理盐水清洗西林瓶内壁，经多次冲洗后得到的混合液体也转移到无菌锥形瓶中，共得到50 mL 混合液体，即待测样品原液。②食品样品样液。与质控样品制作过程相类似，在无菌操作台上，对食品进行切块、粉碎、稀释等处理，从而得到食品样品样液。③稀释溶液。将上述2 种样品样液取出1 mL 添加到9 mL 无菌生理盐水试管中，用滴管搅拌均匀后制备成10 倍稀释度样液，随后再从中抽取1 mL 样液将其转移到9 mL 无菌生理盐水试管中，搅拌均匀后制备成100 倍稀释度样液，待测[2]。

2.3 实验方法

2.3.1 平板计数法

在无菌条件下，用灭菌后的吸管（容量为1 mL）从上述制备的稀释液中吸取1 mL，放入2 个无菌培养皿中，随后利用灭菌吸管（容量为1 mL）吸取1 袋生理盐水，注入平板计数琼脂培养基，提前将温度调整到46 ℃，培养基容积为5～20 mL，按要求进行摇匀操作，等待其冷却凝固后，将其放置在（36±1）℃环境中培养，培养时间控制在（48±2）h。

2.3.2 纸片法

在无菌条件下，用灭菌吸管（容量为1 mL）从上述制备的稀释液中吸取1 mL，放入2 个测试纸片，完成此操作后，覆盖好纸片，将其放置在（36±1）℃环境中进行培养，培养时间控制在（48±2）h。

2.4 统计方法和计算方法

利用平板计数法和纸片法对培养后的菌落进行计数，所得到的数据可利用SPSS 19.0 进行统计学处理，若P ＜0.05，说明具有统计学意义。使用“Z-比分数”进行评价，根据得到的计算数值可以进行以下评价。①如果|Z|≤2，那么此次测试结果为“满意”。②如果2 ＜|Z|＜3，那么此次结果中存在问题，需要采取措施进行处理。③如果|Z|≥3，那么此次测试结果为“不满意”[3]。

3.1 食品检测结果比较

在实验中设置了40 组样品（平板计数法与纸片法各20 组）进行实验，随后利用平板计数法与纸片法进行计数处理，对得到的检测结果利用T检验展开分析，同时对实验结果进行统计学处理。由表1 知：①平板计数法所得到的计算结果为235.6 CFU·g-1，t值为-0.345，同时P＞0.05，表明采用平板计数法计算菌落总数结果不显著。②纸片法得到的计算结果为278.9 CFU·g-1，t值为-0.366，同时P＞0.05，与平板计数法相比，二者在显著性方面并没有明显区别。由标准样液的参考值253.3 CFU·g-1来看，平板计数法更具备应用价值[4]。

表1 食品检测结果表

3.2 菌落数区间结果比较

参考2.1 内容对菌落区间进行等级划分，分别为0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和＞1 000 CFU·g-1，并对实验结果进行统计学处理，分析结果见表2。由表2 可知：①平板计数法所得到0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和＞1 000 CFU·g-1的菌落区间对应t值分别是-0.345、-0.376、-0.843，同时P＞0.05，表明平板计数法在使用过程中，其检测菌落区间差异不显著。②纸片法所得到的不同菌落区间t值分别是-1.753、-1.766、-1.466，同时P＞0.05，表明纸片法在使用过程中，其检测菌落区间差异不显著。标准样液0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和 ＞1 000 CFU·g-1的菌落区间对应t值为-0.435、-0.436、-0.703。将平板计数法与纸片法不同菌落区间的t值和标准样液的t值对比之后可以发现，在该实验中平板计数法更具备应用价值[5]。

表2 菌落数区间结果表

3.3 质控样品菌落总数检测结果分析

本实验中设置了质控样品实验，随后利用平板计数法与纸片法进行计数处理，得到的检测结果利用T检验展开分析，同时对实验结果进行统计学处理，结果见表3。由表3 可知：①平板计数法的平均菌落数为16 000 CFU·g-1，t值为-0.325，同时P＞0.05，Z值为1.2，表明平板计数法在使用过程中，其检测菌落总数结果之间的差异不显著。②纸片法的平均菌落数为为20 000 CFU·g-1，t值为-0.336，同时P＞0.05，Z值为1.5，表明纸片法在使用过程中，其检测菌落总数结果之间的差异不显著。此外，根据Z值统计结果显示，在质控样品的实验中，2 种方法都可以满足相应的检测要求，其均适用于该样品检测。

表3 质控样品菌落总数检测结果表

在此次研究中，通过组建实验的方式讨论平板计数法与纸片法在食品菌落总数校核中的应用情况。实验结果显示，2 种方法在应用中并不存在显著性差异，均具有应用价值。在平板计数法的应用过程中，一个稀释梯度需要使用2 个平板，而检测某一个样品的菌落总数，则需要使用多个梯度，也会使用数量更多的平板，整体所占体积较大。许多检测机构的场地相对有限，无法购买更多数量的培养箱用于制备培养基，另一方面，由于其检测结果的准确性较高，主要应用于一些高精度检测要求的食品检测。

与平板计数法相比，纸片法操作过程简单，减少了人力成本的支出。在检测中使用的主要载体为相同厚度的薄纸片，根据需要分析的梯度配置相应数量的薄纸片，所占空间较小，适用于目前许多检测场地较小、送检样品较多的机构。但是其准确性方面不如平板计数法，适合用于一些快速检测活动。

平板计数法与纸片法均能够对菌落总数进行测定。平板计数法的检测准确性更高，该方法的应用前提条件是需要做好样品的稀释工作，同时做好无菌化处理，以满足相应的管理需求。纸片法的检测速度快，适用于许多检测场地较小、送检样品较多的机构。具体选择哪一类检测方法，需根据精度要求等实际情况进行选择，以提高实验检测结果的准确性。