迷迭香酸对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞衰老及HMGB1，Caveolin-1通路的影响

关小荣，李 蓉，姚国敏(西北工业大学医院眼科，西安 7007；
西安医学院第一附属医院眼科；
通讯作者，E-mail:rechelrong98@63.com)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是全球老年人视力丧失的主要原因，正逐步构成具有重大社会经济影响的公共卫生问题。随着65岁以上人群数量的增长，预计到2050年，全球AMD人数将达到544万[1]。AMD的特征为细胞外沉积物即玻璃膜疣(drusen)的聚集，伴随着光感受器及邻近组织的进行性变性。AMD是一种多因素致盲疾病，其确切病因尚不清楚。已有研究证实，衰老[2]，DNA损伤[3]、氧化应激[4]可影响视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)的衰老、自噬功能和免疫炎症反应，这些因素相互作用，从而导致AMD的发生[5]。RPE是位于脉络膜和神经视网膜之间的上皮细胞，具有分泌生长因子、抗氧化、参与视网膜循环代谢、维持血-视网膜屏障及吞噬视细胞脱落的外节膜盘等重要生理功能，在眼的发育和视觉功能中发挥重要作用。细胞衰老是导致视网膜等眼部结构生理和病理异常的重要原因，且与糖尿病性视网膜病变、视网膜色素变性及AMD的发生有关[6]。RPE细胞衰老会损伤其吞噬和屏障功能，同时导致神经营养障碍和血管生成因子分泌异常。因此，阐明RPE细胞衰老的机制有助于深入理解AMD等视网膜变性疾病的病理机制，进而为开发新的治疗药物提供思路。

迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然的水溶性酚酸类化合物，广泛存在于多种唇型科和紫草科植物中。由于RA在多种不同的细胞中有抗氧化、抗炎、抗衰老[7]、抗病毒、抗血管生成等作用，如今已成为医学和科学研究的热点[8]。近年来，RA已被应用于眼科的临床研究和动物模型以及体外培养细胞模型的实验研究，在多种眼病中展现出一定的治疗潜能[9，10]。然而RA对AMD的效应及其机制尚未明确，本研究拟观察RA对AMD中RPE细胞衰老的作用以及分子机制，以期为后续研究RA的药理作用奠定实验基础。

1.1 细胞株、主要试剂与仪器

ARPE-19细胞系(武汉普诺赛生命科技有限公司)；
DMEM/F12细胞培养基、青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司)；
胎牛血清(美国ExCell Bio公司)、CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(美国MCE公司)，DMSO(美国Gibco公司)，迷迭香酸(上海源叶生物科技有限公司)，衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)，兔多抗P16、兔多抗P21(武汉三鹰生物技术有限公司)，兔单抗高迁移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)、兔单抗微囊蛋白1(Caveolin-1)(美国Abcam公司)，兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司)，HRP标记羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术有限公司)，CO2培养箱[上海一恒科学仪器有限公司，BPN-150CH(UV)型]；
倒置显微镜(广州市明美光电技术有限公司，MF52-N型)；
酶标仪(美国BioTek公司，C22.2NO.1010.1型)。

1.2 细胞处理及分组

将ARPE-19细胞从液氮中取出，快速放入37 ℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；
溶解后把细胞转移到含有5 ml DMEM/F12培养基的离心管中，离心收集细胞，室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清；
用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。细胞的密度达到80%时，对细胞进行传代：弃去培养基，用PBS洗一遍；
加2 ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞2 min，可见细胞相互分离变圆；
快速弃去胰酶，加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下扩大培养。

首先参考文献常用的诱导方法[11]，采用不同浓度(0，100，200，400，800及1600 μmol/L)H2O2处理细胞24 h，CCK-8法检测细胞增殖，筛选合适H2O2浓度构建细胞衰老模型。然后用不同浓度(0，20，40，80 μmol/L)的RA预处理衰老细胞48 h，之后加入最佳浓度H2O2刺激24 h，CCK-8法检测细胞增殖，筛选最佳RA干预浓度。最后将细胞分为对照组、H2O2组(最佳浓度)、H2O2+RA(最佳浓度RA预处理细胞48 h)组，分别培养24 h，观察各组细胞形态及衰老情况，检测衰老标志蛋白(P61和P21)的表达。

1.3 CCK-8法检测细胞活性

取处于对数生长期，生长状态良好的ARPE-19细胞，以5×103个/孔接种于细胞培养96孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h(在细胞孔周围孔内加入100 μl无菌PBS)，用不同浓度的H2O2(0，100，200，400，800及1 600 μmol/L)处理细胞24 h。然后每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃培养4 h，酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值OD。细胞增殖率(%)=(OD实验组-OD空白孔)/(OD空白对照组-OD空白孔)×100%。

1.4 SA-β-gal染色法检测细胞衰老

根据衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-gal)说明进行操作。将100 mg X-gal粉末用5 ml二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解混匀，分装至1.5 ml洁净离心管中，每管0.5 ml，-20 ℃避光保存；
按照每1 ml加β-半乳糖苷酶染色液A 940 μl，β-半乳糖苷酶染色液B 10 μl，X-gal溶液50 μl比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液；
细胞处理所需时间后吸除细胞培养液，用PBS洗涤2次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min；
弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次2 min；
弃去PBS，每孔加入1 ml β-半乳糖苷酶染色工作液，置于37 ℃孵育过夜；
弃去染色工作液，显微镜下随机选取5个视野拍照，计算每个视野中染色细胞所占的比例即为细胞衰老率。

1.5 Western blotting法检测P16，P21，HMGB1和Caveolin-1的表达

收集各处理组细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度；
每个样本取40 μg蛋白在10% SDS-PAGE上电泳，然后转移到PVDF膜上；
用含5%脱脂奶粉的TBST溶液浸泡PVDF膜，室温下振荡封闭2 h；
分别采用P16抗体(1 ∶4 000)、P21抗体(1 ∶2 000)、HMGB1抗体(1 ∶10 000)、Caveolin-1抗体(1 ∶1 000)、GADPH抗体(1 ∶1 000)于4 ℃条件下孵育PVDF膜过夜；
TBST充分洗膜后，用HRP标记的相应二抗(1 ∶600)常温振荡孵育2 h；
TBST充分洗膜，ECL显色曝光，扫描X光胶片，用IPP软件分析胶片灰度值，以GAPDH为内参照，计算各目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2.1 不同浓度H2O2刺激下ARPE-19细胞活性

显微镜下见对照组细胞状态良好，细胞边缘清晰可见，整体密度在80%以上。100 μmol/L H2O2组细胞开始出现老化，颗粒增多，细胞边缘开始模糊；
200 μmol/L H2O2组较100 μmol/L组细胞状态变化较小，但整体密度下降；
400 μmol/L H2O2组细胞损伤严重，细胞形态出现改变；
800 μmol/L H2O2组和1 600 μmol/L H2O2组细胞严重损伤，视野内没有完整的活细胞。CCK-8检测结果显示，随着H2O2浓度增加，细胞增殖率逐渐下降(各浓度组两两比较，均P<0.01，见图1)。结合细胞形态变化及细胞增殖检测结果，在后续研究中采用200 μmol/L作为H2O2的刺激浓度，以观察细胞衰老情况。

与0 μmol/L组比较，*P<0.01；
与100 μmol/L组比较，#P<0.01；
与200 μmol/L组比较，&P<0.01；
与400 μmol/L组比较，$P<0.01；
与800 μmol/L组比较，@P<0.01图1 不同浓度H2O2对ARPE-19细胞活性的影响 (标尺=100 μm)Figure 1 Effects of different concentrations of H2O2 on the activity of ARPE-19 cells (bar=100 μm)

2.2 不同浓度RA对H2O2刺激下ARPE-19细胞活性的影响

显微镜下：对照组细胞状态良好，细胞边缘清晰可见，整体密度在90%以上。200 μmol/L H2O2组细胞开始出现老化，颗粒增多，细胞边缘开始模糊，整体细胞密度稍有下降；
H2O2+20 μmol/L RA组细胞密度较H2O2组回升，状态仍然较差；
H2O2+40 μmol/LRA组细胞状态较H2O2+20 μmol/L RA组好，细胞边缘可看清；
H2O2+80 μmol/L RA组比H2O2+40 μmol/L RA组细胞状态变化较小(见图2)。CCK-8检测结果提示，随着RA浓度增加，细胞增殖率逐渐增加(各浓度组两两比较，均P<0.01)。结合细胞形态变化及细胞增殖检测结果，在后续研究中采用80 μmol/L作为RA的干预浓度，以观察对细胞衰老的影响。

与对照组比较，*P<0.01；
与200 μmol/L H2O2组比较，#P<0.01；
与20 μmol/L RA组比较，&P<0.01；
与40 μmol/L RA组比较，$P<0.01图2 不同浓度RA对ARPE-19细胞活性的影响 (标尺=100 μm)Figure 2 Effects of different concentrations of rosmarinic acid on the activity of ARPE-19 cells (bar=100 μm)

2.3 RA对H2O2刺激下ARPE-19细胞衰老的影响

SA-β-gal细胞衰老染色法结果显示，与对照组相比，H2O2处理组染色的细胞比例明显增加(P<0.01)；
与H2O2处理组相比，H2O2+RA组细胞状态明显改善，视野下染色的衰老细胞比例相对下降(P<0.01，见图3)。Western blotting法检测衰老蛋白的结果显示，与对照组相比，H2O2组P61和P21的蛋白表达量明显增加(均P<0.001)；
与H2O2组相比，H2O2+RA组P61和P21的蛋白表达量明显减少(均P<0.01，见图4)。

与对照组比较，*P<0.05；
与H2O2组比较，#P<0.05图4 Western blotting法检测各组ARPE-19细胞衰老蛋白P16及P21的表达Figure 4 Expression of senescence proteins P16 and P21 in ARPE-19 cells by Western blotting

2.4 RA对H2O2刺激下ARPE-19细胞表达HMGB1和Caveolin-1的影响

Western blotting法检测结果显示，与对照组相比，H2O2组HMGB1和Caveolin-1的蛋白表达量明显增加(均P<0.01)；
与H2O2组相比，H2O2+RA组HMGB1和Caveolin-1的蛋白表达量明显减少(均P<0.05，见图5)。

与对照组比较，*P<0.05；
与H2O2组比较，#P<0.05图5 Western blotting法检测各组ARPE-19细胞HMGB1和Caveolin-1的表达Figure 5 Expression of HMGB1 and Caveolin-1 proteins in ARPE-19 cells by Western blotting

细胞衰老是其生理功能和增殖及分化能力逐渐下降的过程[12]。它也是一种永久的细胞分裂停止状态，只涉及有丝分裂细胞。尽管RPE细胞在视网膜中是静止的，它们也经历了氧化应激诱导的衰老过程。因此，细胞衰老被认为是AMD病理中的重要分子途径[13]。视网膜衰老是AMD发病机制的一个重要组成部分，其特征是drusen沉积的积累、Bruch膜和细胞外基质组成的改变、血管炎症和调节失调、线粒体功能障碍、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累，以及随后的RPE细胞衰老。由于目前预防和治疗AMD的选择有限，人们正不断研究AMD的新治疗靶点，以确定新的干预措施。H2O2是一种ROS，可诱导许多细胞事件，包括细胞衰老和炎症反应[7]。本研究采用了经典的H2O2诱导法建立RPE细胞衰老模型[14]，观察RA对细胞衰老的影响和分子机制。结果提示细胞建模成功，H2O2刺激组ARPE-19细胞中衰老标记蛋白P16和P21[15]的表达明显上调，SA-β-gal染色显示衰老细胞比率明显增多。

HMGB1是一种丰富的、进化上保守的非组蛋白，它聚集DNA，使转录因子进入启动子区域从而调控转录。此外，HMGB1也是损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)的组成部分，与氧化应激和下游凋亡或生存相关[16]。研究发现HMGB1是衰老表型的中心调控者[17]，在衰老细胞中HMGB1的表达上调，并从细胞核移位到细胞质和细胞外。衰老细胞分泌的HMGB1可刺激细胞因子分泌或免疫细胞募集，从而刺激免疫系统去除衰老细胞。本研究检测了HMGB1在H2O2诱导的RPE中的表达，确定该蛋白在衰老细胞中表达上调，与Sun等[18]的研究结果一致。本研究还观察了另一RPE细胞年龄相关蛋白Caveolin-1，它是细胞表面的穴样内陷(caveolae)的主要成分，在大多数细胞类型中可见，参与调节多种细胞过程，例如线粒体功能、增殖、迁移和衰老[19]。上调Caveolin-1通过抑制受体酪氨酸激酶活性抑制细胞增殖，Caveolin-1通过上调Rb家族和局灶性黏附蛋白导致衰老细胞变大变平；
而下调Caveolin-1可逆转衰老表型。衰老与对通过caveolae与Caveolin-1发生相互作用的生长因子的反应减弱密切相关，Caveolin-1在复制性衰老(体细胞自发实现)和应激诱导的早衰(DNA损伤、细胞毒性药物、氧化应激和致癌基因激活等)中都发挥着重要作用，参与调节衰老细胞中的多种信号通路，如p53/p21waf1/Cip1、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、局部黏附激酶(focal adhesion kinase，FAK)和小Rho GTPas通路[20]。Sun等[17]研究人诱导多功能干细胞(iPSC)-RPE的结果表明，HMGB1的上调和释放增强了Cavelin-1的表达，提示HMGB1和Cavelin-1在RPE细胞衰老过程中具有协同作用。本研究结果显示在H2O2诱导模型中，ARPE-19细胞Caveolin-1表达增强，提示HMGB1和Caveolin-1均是RPE细胞衰老的主要守门者，稳定二者的表达是预防RPE细胞衰老进展的潜在治疗靶点。

虽然AMD是一种多因素疾病，具有血管生成、免疫和炎症成分，但最常见的临床治疗策略是抗血管生成治疗[21]。然而，这些策略仅适用于新生血管性AMD，其占所有AMD病例的比例不到20%，而且目前还没有FDA批准的药物用于治疗干性AMD，其占AMD病例的比例约为80%。随着研究的不断深入，多种中医药疗法在AMD治疗上的作用也逐渐显现[22，23]。新近研究提示，消除衰老细胞是一种潜在的、用以治疗所有类型AMD的新疗法[24]。RA是从唇形科植物迷迭香中分离得到的一种天然水溶性多酚羟基化合物，具有多种药理学功能，如抗氧化、抗炎、抗病毒，抗肿瘤等，并得到了国内外众多学者的认可[25]。在本研究中，RA能明显抑制H2O2诱导下的ARPE-19细胞的衰老，提示RA可作为AMD的潜在治疗药物。此外，RA同样对H2O2诱导的ARPE-19细胞中的HMGB1和Caveolin-1表达有明显的抑制作用，进一步说明了RA作为抗细胞衰老的治疗药物，在AMD中具有非常广阔的应用潜力。

综上所述，RA能够抑制RPE细胞衰老，机制可能与其抑制衰老关键调控蛋白HMGB1和Caveolin-1的表达有关。本研究为AMD的中药治疗以及利用衰老细胞作为治疗AMD的靶点提供了新的见解。然而，本研究未能通过干预HMGB1和Caveolin-1信号通路来观察RA是否对H2O2诱导的细胞衰老发挥抑制作用，故无法证明二者的直接关联。已有研究证实了HMGB1和Caveolin-1信号通路在细胞衰老中的作用并揭示了部分分子机制，HMGB1上调和释放可促进Caveolin-1的表达，但二者如何调控AMD中的RPE衰老还不清楚。此外，AMD发病机制关系复杂，RA是否通过其他信号通路发挥作用还需要进一步深入探究。