经典组蛋白去乙酰化酶在中枢神经系统中作用

于美华 包金风

(内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

表观遗传学是指不改变脱氧核糖核酸(DNA)序列而产生的可遗传变化，其在调节基因组功能中发挥关键作用，影响基因表达和(或)转录，从而调控机体的生长、发育及病理过程〔1〕。表观遗传学修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码核糖核酸(RNA)等。组蛋白乙酰化核酸修饰是调节DNA功能的重要方式，近年来，研究表明组蛋白乙酰化在神经系统疾病发生发展中起重要作用〔2〕。

染色质由DNA和组蛋白等组成，其基本结构单位是核小体，它是由4个基本组蛋白(H3，H4，H2A和H2B)组成的八聚体。每个组蛋白八聚体都被147个碱基对的DNA包裹〔3〕。染色质是一种非常活跃的结构，它能够响应DNA的各种信号及通过转录过程调控基因表达。染色质对转录的影响受多种酶调控，这些酶会“生成”“读取”和“擦除”各种表观遗传修饰，从而促进或抑制基因转录，如组蛋白乙酰化转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)等，这些酶对基因转录调节起重要作用。

组蛋白乙酰化是指在HATs作用下组蛋白赖氨酸的尾端上添加乙酰基，使组蛋白与DNA的结合位点变得松弛，从而改变染色体转录活性。乙酰化修饰参与基因转录、蛋白降解和细胞代谢等多个细胞过程〔4〕。HDACs则去除乙酰基，正常情况下与HATs和HDACs维持组蛋白乙酰化及去乙酰化动态平衡〔5〕。HDACs抑制剂(HDACi)通过抑制HDACs活性调控基因表达，在神经系统疾病治疗中具有潜在临床价值〔6〕。

目前已知的HDACs共有18种，根据它们与酵母组蛋白脱乙酰基酶的同源性将其分为四类：Ⅰ类HDACs (HDAC1，2，3和 8)；
Ⅱ类HDACs( Ⅱa：HDAC4、5、7和9；
Ⅱb：HDAC6和10)；
Ⅲ类通常称为沉默信息调节因子(SIRT)，包含SIRT1-7；
Ⅳ类仅包含一种非典型HDAC同工型11。其中Ⅲ类属于依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的沉默调节蛋白，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类属于依赖Zn2+的HDACs，被称为经典HDACs〔7〕。

神经发生指新的神经元生成过程，包括神经干细胞(NSCs)增殖分裂成为祖细胞，并逐渐向功能区域迁移、不断发生可塑性变化并与其他神经元建立突触联系从而产生成熟神经元的一个复杂的过程。此过程涉及大量特定基因的调控，而染色质结构调节是转录的调控关键，如对其进行修饰以促进或阻止转录因子和RNA聚合酶复合物与其结合。HDACs是调节染色质结构的一类酶，HDACs除了改变染色质结构和组蛋白乙酰化导致基因转录改变外，HDACs还可使大量非组蛋白蛋白质脱乙酰化，如转录因子、结构蛋白、离子通道、受体和酶等〔5〕。其中，转录因子的乙酰化状态会改变DNA结合特性和转录活性，而且，这些蛋白质的脱乙酰基可以对其功能、稳定性、亚细胞定位产生影响，并同时影响与它们相互作用的蛋白质。例如，研究表明HDAC1，2和3使丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸酶(MKP)1脱乙酰化，并且这种翻译后修饰增加了MAPK和免疫信号传导〔8〕。研究发现，组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的平衡破坏可直接引起或导致神经发育障碍和神经精神疾病等〔9〕。研究表明HDACs参与和年龄相关的神经退变过程〔10〕。这意味着HDACs可以通过组蛋白去乙酰化和基因表达变化或通过其他机制发挥其神经毒性或神经保护作用。

3.1Ⅰ类HDACs Ⅰ类HDACs主要定位于细胞核，而HDAC3可定位于细胞质和细胞核。HDAC 8在平滑肌中表达，目前研究认为其对神经系统影响较少。而HDAC1、2、3在神经发育发生及病理过程具有重要作用。

3.1.1HDAC1和HDAC2 HDAC1和HDAC2具有高度同源性，对组蛋白表现出很高的酶促活性，不同的细胞类型中或对不同的刺激和信号传导途径作出反应时显示出功能重叠和互补。皮层发育早期阶段，两种蛋白都在神经上皮细胞(NECs)和神经祖/前体细胞(NPC)中高表达〔11〕。出生后，HDAC1主要在神经胶质细胞中表达，而HDAC2主要在新皮层和其他大脑区域的成熟神经元中表达〔12〕。

HDAC1和HDAC2在调节胚胎干细胞(ESCs)和NSCs的增殖和神经分化中具有重要作用。研究发现，缺失HDAC1或HDAC2的小鼠脑部无明显异常，然而，同时敲除小鼠NPC和星形胶质细胞中HDAC1和HDAC2，会在出生后第7天左右表现为严重的脑部发育异常或死亡，研究发现皮质、海马和小脑在内的大脑区域的发育受到严重影响，NPC的增殖增加，但分化受损〔13〕。小鼠胚胎着床前敲除HDAC1或HDAC2不会影响胚胎形成，但同时敲除HDAC1和HDAC2则影响桑椹胚到囊胚的过渡从而致死〔14〕。这些结果也说明HDAC1和HDAC2具有功能上的互补和重叠。

HDAC1和HDAC2发挥神经毒性或神经保护作用取决于其细胞定位、组蛋白乙酰化及非组蛋白乙酰化作用。研究发现，使用小干扰RNA(siRNA)沉默HDAC1的人脐带间充质干细胞移植治疗脑外伤小鼠，可能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路促进移植后神经元的迁移和神经分化，表现为神经发生增强、神经凋亡减少，并能减少海马的氧化应激，从而提高脑外伤小鼠模型中人脐带间充质干细胞移植的疗效〔15〕。TAR DNA结合蛋白(TDP)-43是一种主要位于细胞核中DNA/RNA结合蛋白，研究发现，TDP-43蛋白错叠可导致额颞叶变性(FTLD) 和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)等多种神经退行性疾病。研究发现，HDAC1从核到胞质错误定位可诱导与TDP-43蛋白异常相关疾病神经细胞细胞周期异常和DNA损伤〔16〕。

HDAC1和HDAC2通过调节染色质修饰还参与突触可塑性和记忆形成，并在与突触可塑性有关的神经系统疾病发生和发展过程中起重要作用。Angelman综合征是一种神经突触发育障碍性疾病，其特征是母体遗传的泛素蛋白连接酶(UB)E3A基因功能丧失导致严重的智力和发育缺陷。研究发现，在Angelman综合征小鼠中，HDAC1和HDAC2蛋白水平均显着升高，同时组蛋白H3/H4的乙酰化水平降低〔17〕。帕金森病(PD)受试者黑质小胶质细胞中HDAC2明显上调，并伴随多巴胺能神经元细胞的丢失〔18〕。通过敲低HDAC2可提高阿尔茨海默病(AD)CK-p25小鼠模型的突触可塑性和记忆力〔11〕。这些研究表明HDAC2在神经退行性疾病的发生发展过程中起重要的作用。Abelson酪氨酸激酶(c-Abl)通过诱导HDAC2磷酸化，增加组蛋白H3脱乙酰基作用将HDAC2募集至突触可塑性关键基因，如突触结合蛋白、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基NR2a和谷氨酸受体(GluR)1的启动子上，从而诱导转录抑制〔19〕。

3.1.2HDAC3 与其他Ⅰ类HDACs不同，HDAC3既定位于细胞核，又定位于细胞质。研究表明HDAC3是一种具有较强神经毒作用的蛋白。HDAC3是脑中表达水平最高的Ⅰ类HDACs，尤其在发育小鼠的脑中高表达，表明HDAC3与脑发育有关〔20〕。该基因在脑中特异性失活可诱发幼鼠活动过度、焦虑、严重的发育缺陷及早期死亡，Li等〔21〕推测这可能是HDAC3在大脑中的特异性缺失促进了过早的神经发生造成的，ESCs和NSCs在自我更新和分化之间处于动态平衡状态，敲除HDAC3小鼠海马中，NSCs细胞周期异常停滞并进行神经元分化，而神经发生促进基因如神经源分化因子(NeuroD)1转录增加。这些结果表明正常水平的HDAC3对于神经发育至关重要。

HDAC3可能通过抑制神经元存活所需的基因表达来促进神经变性。神经元PAS结构域蛋白(Npas)4和脑源性神经营养因子(BDNF)在脑发育和学习记忆相关突触可塑性形成及神经退行性疾病中起关键作用〔22〕。研究发现，Npas4和BDNF都是HDAC3靶基因，使用腺病毒在皮质神经元中过表达HDAC3可抑制Npas4和BDNF启动子活性，使其表达降低，给予HDAC3抑制剂RGFP-966处理则可使Npas4和BDNF表达上调〔23〕。故HDAC3神经毒作用可能部分通过降低Npas4和BDNF转录介导。

最近研究发现，HDAC3也是长期记忆形成和学习能力的关键负性调控因子。小鼠海马CA1中HDAC3基因缺失或抑制能够增强小鼠对物体定位的长期记忆，而 HDAC3 的高表达能促进神经元变性坏死〔24〕。敲除HDAC3可增加生物钟基因Period(Per)1启动子的乙酰化进而增加其表达。由于海马Per1表达对于长期记忆形成起关键的作用，过表达Per1可改善与年龄有关的记忆障碍，而HDAC3的缺失可改善衰老小鼠记忆能力和突触可塑性〔25〕。核受体亚家族4a组成员(Nr4a)2是记忆形成有关并能够调节多种生物学过程的转录因子。HDAC3通过去乙酰化使Nr4a2启动子的染色质处于封闭状态而减少其表达，而Nr4a2能够和Bdnf启动子区域结合，从而促进长期记忆形成〔26〕。有研究发现，HDAC3在与可卡因相关的记忆消退有关的特定大脑区域中起作用〔27〕，HDAC3可能参与药物依赖性的产生。利用HDAC3选择性抑制剂RGFP-966抑制HDAC3可降低病理性tau磷酸化和乙酰化作用，降低脑和周围区域的β-淀粉样蛋白(Aβ)蛋白表达，增加周围区域的Aβ降解，改善3xTg-AD模型小鼠的学习和记忆能力，并使许多与AD相关的基因正常化〔28〕。因此，选择性HDAC3抑制剂可能有助于改善长期记忆和学习能力，这为未来AD等疾病药物治疗提供新的研究靶点。

3.2Ⅱa类HDACs HDAC Ⅱa具有在细胞核与细胞质之间穿梭的能力，一般情况下处于非磷酸化状态，在特定信号因子作用下可被磷酸化，磷酸化后与转录因子相互作用而被募集到靶基因，发挥抑制基因转录的作用。肌细胞增强因子(MEF)2是神经系统重要的转录因子，研究表明，Ⅱa类HDACs都具有MEF2依赖性转录抑制作用。

3.2.1HDAC4 HDAC4在脑中广泛表达，其中在小脑、海马和嗅球中表达较高。在静息状态时，HDAC4主要在细胞质中，但HDAC4受钙/钙调蛋白依赖性激酶介导的磷酸化的调节下，抑制突触活性或阻断核钙信号传导可导致HDAC4在细胞核中集聚〔29〕，如在脑卒中和PD等疾病中已经观察到神经元细胞核中HDAC4表达水平的升高，并与神经元死亡和疾病进展相关〔30，31〕。研究发现，HDAC4的核易位在缺血性脑病中具有保护作用〔28〕。因此，HDAC4的核聚集增多可促进神经元退化。血管内皮生长因子(VEGF)D是维持树突结构的关键蛋白，HDAC4的核聚集可通过下调VEGFD的表达使树突结构受损〔32〕。

近年来研究发现，HDAC4在脑中具有较少脱乙酰基酶活性。HDAC4通过与其他HDACs或其他调节蛋白的相互作用而发挥其作用。如亨廷顿病(HD)是由亨廷顿蛋白(HTT)外显子内胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复次数增加引起的，这种扩增可产生具有聚谷氨酰胺(polyQ)残基的突变蛋白(mHtt)，这种突变蛋白易于聚集，从而导致蛋白质错叠，最终导致神经元功能障碍和细胞死亡。HDAC4能够以polyQ依赖的方式与突变的mHtt相互作用增加mHtt聚集，同时，HDAC4基因敲低可改善了HD小鼠的病理特征〔33〕。

3.2.2HDAC5 HDAC5具有Ⅱa类特异性核质穿梭能力，也是关键的转录调节因子。

此外，钙和蛋白激酶C依赖性HDAC5从细胞核向细胞质易位可导致组蛋白乙酰化增加，恢复促进神经元存活和轴突生长的基因转录，如激活转录因子(ATF)3〔29〕。这表明HDAC5的去乙酰化作用和核质穿梭能力在轴突再生中发挥重要作用。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种高度保守的丝氨酸(Ser)-苏氨酸激酶，mTOR控制干细胞的发育，参与调节基因翻译、细胞生长、代谢、凋亡，在神经保护中具有重要作用。HDAC5通过使mTOR相关调节蛋白Raptor脱乙酰化激活mTOR途径，促进视神经再生〔34〕。神经元膜糖蛋白(GP)M6A是HDAC5调控的转录因子MEF2C的直接靶基因，在神经发育过程起重要作用。微小RNA(miR)-124和miR-9通过靶向其3"-非翻译区(UTR)直接抑制HDAC5的表达，激活MEF2C-GPM6A途径促进神经元轴突和树突发育〔35〕。PD早期发展与α-突触核蛋白(Syn)诱导的多巴胺能神经元变性密切相关，HDAC5在成年小鼠黑质致密区多巴胺能神经元中表达，研究显示，使用siRNA敲减HDAC5的可促进SH-SY5Y细胞中的神经元轴突生长，HDAC5抑制剂MC1568能够上调神经营养因子骨形成蛋白(BMP)2的表达，并促进培养的大鼠多巴胺能神经元轴突和树突生长〔36〕。综上所述，HDAC5在神经元中的高表达及核聚集都具有神经毒性作用，而核移出及HDAC5抑制剂可能成为治疗PD等神经退行性疾病的药物研究的靶标。

3.2.3其他Ⅱa HDACs 研究发现HDAC7的去乙酰化作用促进神经胶质瘤发展。锌指蛋白(ZNF)326可以通过其转录激活结构域和锌指结构与HDAC7特定启动子区域结合而激活HDAC7转录，上调的HDAC7与β-连环蛋白(catenin)的相互作用导致赖氨酸(Lys)-49的β-catenin乙酰化水平降低，由于改变空间位阻并抑制相邻的Ser-45的β-catenin磷酸化水平，未磷酸化的β-catenin则可以进入细胞核并激活Wnt信号通路促进神经胶质瘤发生和发展〔37〕。

研究发现HDAC9参与调节轴突分支。在体外培养的丘脑和皮层细胞中，荧光蛋白标记的HDAC9在培养过程中在核质中穿梭。转染基因突变的HDAC9则减少体外培养丘脑皮质(TC)的轴突分支。但破坏HDAC9和MEF2之间的相互作用，可逆转轴突分支，表明HDAC9的核质易位通过影响转录调节和下游信号转导途径在TC轴突分支过程中起关键作用〔38〕。

3.3Ⅱb类HDACs HDAC Ⅱb具有2个脱乙酰基酶结构域，参与微管和肌动蛋白依赖性细胞运动调控。HDAC6被认为是哺乳动物细胞中最主要细胞质脱乙酰酶，除组蛋白，HDAC6还可使中枢神经元相关蛋白去乙酰化，在突触形成和递质运输过程中起关键作用，而关于HDAC10的了解较少。

HDAC6具有同其他的HDACs不同的特点，即特异性定位于细胞质并具有两个催化结构域。因HDAC6的无序N末端是微管结合域，因此，HDAC6最先被认为是α-微管蛋白(tubulin)脱乙酰基酶〔39〕。后来发现HDAC6也可使其他蛋白脱乙酰化，如tau蛋白、热休克蛋白(HSP)90、皮层肌动蛋白结合蛋白(cortactin)等〔40〕。HDAC6发挥作用与其对不同的目标蛋白乙酰化作用有关，而不是对组蛋白乙酰化作用和随后对染色质产生作用的结果。

已知tau蛋白磷酸化和Aβ沉淀聚集是AD的重要病理学特征。Tau蛋白过度磷酸化会促进tau蛋白聚集，从而降低其结合和稳定微管的能力。研究表明，HDAC6能够与人脑组织中的tau蛋白相互作用，抑制HDAC6作用可减弱tau蛋白T231位点的磷酸化〔41〕。此外，使用HDAC6的新型抑制剂MPT0G211能够使AD模型中tau 蛋白的磷酸化水平降低，并改善认知功能障碍〔42〕。最新研究发现，异常的tau蛋白乙酰化导致有毒tau蛋白低聚物的形成促进突触变性和认知功能障碍，HDAC6不仅能使tau蛋白脱乙酰化，而且还可抑制微管结合区内tau蛋白的过度磷酸化，这可能与脑的病理状态有关，如在tau蛋白病变低于特定阈值的条件下，HDAC6的丢失或抑制可能具有神经保护作用〔43〕。Aβ 影响微管及其信号通路，进而影响细胞内囊泡运输，最终使线粒体和神经递质的传递速率减慢、突触降解。抑制 HDAC6使过氧化物还原酶(Prx)1乙酰化增强，可挽救 Aβ 引起的线粒体轴突运输的损害〔44〕。因此，抑制 HDAC6 可使 tau 蛋白降解，缓解Aβ产生的损伤，因此，HDAC6特异性抑制剂可能是治疗AD的有效的药物。

微管是细胞骨架的主要成分，对于维持细胞形状、轴突再生、物质转运、细胞运动、DNA 分离等都起到不可或缺的作用。在微管形成过程中，α-tubulin翻译后修饰，如乙酰化对于微管及细胞功能的维持都至关重要。HDAC6过表达则可使 tubulin 脱乙酰化，从而降低微管稳定性〔45〕。硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)是中枢神经系统轴突生长的抑制剂，CSPG和 MAG 能够下调α-tubulin乙酰转移酶(TAT)1，与HDAC6协同导致α-tubulin乙酰化减少，而抑制HDAC6可以逆转CSPG和MAG对轴突生长的抑制作用〔46〕。研究表明，在PD和ALS等中枢神经退行性疾病中，抑制HDAC6所发挥的神经保护作用都可能与增加 tubulin 乙酰化、改善轴突运输有关〔47，48〕。HDAC6除作用于tubulin还作用于轴突中其他底物，如HDAC6可使线粒体外膜蛋白Miro1 脱乙酰化，降低了轴突中线粒体的运输，而线粒体通过提供三磷酸腺苷(ATP)并充当Ca2+的储存位点，在生长和成熟的轴突中发挥多种作用〔49〕。研究结果表明Miro1的突变会破坏Ca2+稳态，使ATP产生减少和钙依赖性线粒体凋亡和自噬，这可能是PD的发病机制之一〔50〕。

3.4Ⅳ类HDACs Ⅳ只包含一个成员HDAC11，由于其发现较晚，所以对其在中枢神经系统发挥的作用了解较少。有研究发现，HDAC11通过直接结合转录因子PU.1影响趋化因子配体(CCL)2启动子上的PU.1-DNA相互作用来促进CCL2的表达进而促进神经炎症〔51〕。

综上，乙酰化-去乙酰化平衡对于维持正常的基因表达和蛋白质功能至关重要。HDACs作为调控组蛋白乙酰化水平的关键因子，其表达异常则影响基因表达，从而参与多种中枢神经系统疾病的发生发展过程。同时，HDACs还可使非组蛋白蛋白质去乙酰化调控蛋白质功能，故未来研究可将HDACs的异常表达同疾病相关基因和蛋白联系起来探索疾病发生病理生理学基础，并且，合成更多特异性靶向HDACi无论是作为工具药研究HDACs的作用，还是今后作为治疗药物都具有广阔前景。