一测多评法同时测定沙芪浓缩丸中5,种黄酮

萨出拉，王秀枝，杨立国包书茵*，奥乌力吉*

（1.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000；

2.内蒙古自治区蒙医药研究所，内蒙古 呼和浩特 010020；
3.通辽职业学院，内蒙古 通辽 028000）

蒙药沙芪浓缩丸中君药沙蓬是藜科植物沙蓬Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分，为蒙古族习用药材，蒙文名楚力格日，具有祛疫、清热、解毒、利尿等功能［1-2］，用于治疗“疫热增盛，身目黄疸，尿道灼痛，肾热”［3-4］。沙蓬种子是药食同源物，迄今已中分离得到黄酮、三萜皂苷、生物碱、酚苷等化合物［5-7］，研究表明，其皮中的黄酮类成分芦丁、异槲皮苷、异荭草素具有较强的清除自由基DPPH 的能力［8］；
乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有显著降血糖活性，并且水提物、醇提物可显著降低糖尿病大鼠血糖、血脂，改善糖耐量［9-11］，另外该药材对糖尿病肝损伤也有良好的抑制作用［12-13］。目前，正逐步研发沙蓬与不同药物配伍而具有抗氧化、抗炎、改善肝肾功能功效的新药［14］，但尚无沙芪浓缩丸中多成分含量同时测定的报道。

王智民等［15］首次提议，采用一测多评法对中药进行多指标质量控制，它是采用1 种易得对照品作为内标，从而实现对多成分含量同时测定的手段［16-18］。本实验采用该方法同时测定沙芪浓缩丸中毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素5 种黄酮的含量，以期为该制剂质量评价提供有效参考依据。

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies 公司）；
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；
ZDHW 调温电热套（河北中兴伟业实验仪器有限公司）；
CCA-112 冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；
HH-2 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；
TDI0001A、YP10001 电子天平（上海佑科仪器表有限公司）；
KQ-C20 玻璃仪器气流干燥器、R-1010 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；
UPH-I-20L 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；
LDZ4-0.8 离心机（北京医用离心机）；
DHG-9145A 鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
T-1200N 马弗炉（郑州天纵电器设备有限公司）；
锥形瓶；
蒸发皿；
硅胶G 薄层板；
称量瓶；
量瓶；
无灰滤纸；
坩埚。

1.2 试剂与药物 沙芪浓缩丸（自制，批号202009、202105、202106）。毛蕊异黄酮苷（纯度＞98%，CAS 号20633-67-4，批号B20847）、水仙苷（纯度＞98%，CAS 号604-80-8，批号B2179）、异鼠李素（纯度＞98%，CAS 号78-70-6，批号B21554）、银锻苷（纯度＞98%，CAS 号20316-62-5，批号B21578）、芒柄花素（纯度＞98%，CAS 号485-72-3，批号B20836）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯；
其他试剂均为分析纯；
水为超纯水。

2.1 色谱条件 Welch LP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相乙腈（A）-0.4% 磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，15%A；
10～15 min，15%～38% A；
15～25 min，38%～42% A；
25～30 min，42%～82%A）；
体积流量1.0 mL／min；
柱温30 ℃；
检测波长260 nm；
进样量10 μL，色谱图见图1。由此可知，各黄酮色谱峰分离度均大于1.5。

图1 各黄酮HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various flavonoids

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素对照品1.25、1.47、1.23、1.96、2.47 mg，25 mL 70%甲醇摇匀溶解，分别制成每1 mL 分别含各成分0.025、0.029、0.024、0.039 2、0.049 mg 的 溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉末（过4 号筛）约1 g，加50 mL 90% 甲醇（含1% 甲酸），超声（功率100 W，频率40 kHz）处理60 min，滤过，取25 mL 滤液，在40～50 ℃下蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中并定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量，稀释成不同质量浓度（水仙苷0.029 4、0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 mg／mL，银锻苷0.024 6、0.049 2、0.098 4、0.147 6、0.196 8、0.246 mg／mL，毛蕊异黄酮苷0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg／mL，异鼠李 素0.039 2、0.078 4、0.156 8、0.235 2、0.313 6、0.392 mg／mL，芒柄花素0.049 4、0.098 8、0.197 6、0.296 4、0.395 2、0.494 mg／mL），在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各黄酮线性关系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积 RSD 分别为 0.13%、0.17%、0.02%、0.07%、0.07%，表明仪器精密度较好。

2.4.3 稳定性试验 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积RSD 分别为 0.86%、0.77%、0.89%、1.90%、1.10%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一批本品粉末（批号202009）0.5 g，按“2.3” 项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素峰面积RSD 分别为1.57%、1.93%、1.24%、1.13%、1.92%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取同一批本品粉末（批号202009）6 份，每份0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密量取含毛蕊异黄酮苷1.0 mg、水仙苷1.2 mg、银锻苷0.3 mg、异鼠李素0.4 mg、芒柄花素0.3 mg 的对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素平均加样回收率分别为95.80%、98.08%、91.90%、94.66%、99.82%，RSD 分别为0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%。

2.5 相对校正因子考察

2.5.1 计算方法 取“2.2” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以毛蕊异黄酮苷为内标，计算其他4 种黄酮的相对校正因子fk／s，公式为fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各黄酮相对校正因子Tab.2 Relative correction factors for various flavonoids

2.5.2 耐用性试验 本实验分别考察了Waters e2695、Agilent 1260 色谱仪及 Welch LP-C18、Agilent ZORRA plus-C18、Venusil XBP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD ＜2.0%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.3 不同体积流量对相对校正因子的影响 本实验考察了体积流量0.3、0.5、0.8、1 mL／min 对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.4 不同柱温对相对校正因子的影响 本实验考察了柱温25、30、35、40、45 ℃对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.5 不同质量浓度对照品溶液对相对校正因子的影响 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液适量，依次稀释至0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mg／mL，考察它们对相对校正因子的影响，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表6 不同质量浓度对照品溶液对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different concentrations of reference solutions on relative correction factors

2.5.6 检测波长对相对校正因子的影响 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液4 份，分别在252、254、256、260 nm 波长处检测，考察它们对相对校正因子的影响，结果见表7，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表7 不同检测波长对相对校正因子的影响Tab.7 Effects of different detection wavelengths on relative correction factors

2.5.7 样品含量测定 取3 批样品，每批3 份，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表8。由此可知，2 种方法所得结果接近［相对平均偏差（RAD）＜2%］，表明一测多评法可用于本实验含量测定。

表8 各黄酮含量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.8 Results of content determination of various flavonoids（mg／g， n＝3）

沙芪浓缩丸以沙蓬为君药，黄芪为臣药，两者均含黄酮类成分［19-20］，具有抗炎、抗氧化、抑制糖尿病等作用［21-22］。首先，本实验考察不同供试品溶液制备方法，包括提取方法（超声、加热回流）、提取时间（30、60、90 min）、提取溶 剂（90%、70%、40%甲醇及无水甲醇），以各成分提取率为指标，最终确定为90% 甲醇超声提取60 min。然后，筛选不同流动相，包括甲醇-水（含0.2%甲酸）、乙腈-水（含0.2% 甲酸）、甲醇-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷 酸）、乙 腈-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷酸），发现水相中酸浓度较高时各成分分离度较好，色谱峰峰形明显改善，最终确定为乙腈-水（含0.4%磷酸）。最后，采用DAD 检测器在190～400 nm 波长处进行扫描，发现各成分在260、290 nm 处均有吸收峰，以前者更理想，最终确定为260 nm。

本实验建立一测多评法同时测定沙芪浓缩丸中毛蕊异黄酮苷、水仙苷、银锻苷、异鼠李素、芒柄花素5 种黄酮的含量，发现所得结果与外标法接近（相对偏差小于2%），可在相应对照品缺少或难以得到的情况下，以毛蕊异黄酮苷为内标实现含量测定的目的，从而为该制剂的质量控制提供参考。