基于免疫检测的外泌体定量生物传感器研究进展

范翠，彭涛，周明勇，郭宏宇，蒋炳炎

(1.中南大学 高性能复杂制造国家重点实验室，湖南 长沙，410083；
2.中南大学 机电工程学院，湖南 长沙，410083)

癌症本质上是一种复杂且高度异质的疾病，根据起源部位可以分为肺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌和乳腺癌等等。据统计，在我国发病率最高的恶性肿瘤中，男性以肺癌为首，女性以乳腺癌为主；
而死亡率最高的均为肺癌[1]。由于癌症的高发病率和高死亡率等特性，在过去的几十年中一直是科学研究的重点，其早期诊断和有效治疗也是抗癌斗争中的两个最大挑战[2]。目前，癌症早期检测和筛查手段主要有影像学、细胞学、组织病理学和血清学技术，其中影像学检测技术简单快速，但是分辨率不高；
细胞学检测技术主要针对中央型癌细胞，周围型癌细胞难以被检出；
组织病理学检测技术属于有创检查。以上常规方法对于早期癌症的检测效率不高[3]。血清学检测即肿瘤标志物的检测，其含量升高程度间接反映了恶性肿瘤的存在和生长。研究表明，在体液中发现的肿瘤标志物水平升高与某些癌症有显著的相关性，如肺癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]等，在癌症的诊断、预后中均有重要作用，对肿瘤标志物进行定量分析可以在无创的基础上实现癌症的早期诊断、检测肿瘤的治疗效果、提供有关疾病复发过程的信息以及跟踪疾病的进展[8]。

外泌体是由各种活细胞通过内吞—融合—外排等机制产生，并通过主动分泌的方式排出细胞膜外而产生的一种脂质双分子层膜性囊泡。外泌体曾被视为质膜脱落而产生的排泄物，直到2007年，有学者发现外泌体可以作为细胞间基因交流的信使，从此开启了研究的热潮[9]。外泌体携带遗传信息，并通过共享遗传信息来调节细胞行为、调节肿瘤细胞增殖的肿瘤微环境，还能促进肿瘤血管生成，目前已被证实其可用于疾病早诊以及预后、细胞通讯、免疫调节、药物输送等研究[10]。研究表明，癌症患者血液中外泌体的浓度显著高于健康人或者良性肿瘤患者血液中外泌体的浓度，外泌体中的蛋白质和核酸含量也存在差异，恶性肿瘤的生长与外泌体及内容物的数量呈正相关[11]。外泌体作为一种新型肿瘤标志物，近几年在癌症早期诊断和预后中应用越来越广泛[12]。YOKOYAMA 等[13]通过对48 位结直肠癌患者的血清肿瘤标志物癌胚抗原CEA(检测阈值为5 ng/mL)与外泌体表面癌胚抗原exo-CEA 的检测结果进行对比，发现外泌体表面蛋白作为肿瘤标志物对于临床诊断具有更高的准确度。

传统的外泌体检测技术如酶联免疫吸附测定法(ELISA)存在步骤繁琐、样本量大、成本高的缺点；
而动态光散射(DLS)、蛋白免疫印迹法(WB)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)则存在灵敏度差、特异性低的问题。近年来，生物传感器由于其灵敏度高、特异性好等优势引起了科研人员的高度关注。目前，有关生物传感器在外泌体定量检测中的应用研究取得了一定的进展[14-18]。研究表明，1个癌细胞虽然只有1个或者几个拷贝的基因组，但癌症相关蛋白的表达量却相当高，蛋白标记物相比于其他标记物更能实现癌症的早期诊断[19]。目前，基于抗原-抗体反应的免疫生物传感检测技术研究已经取得了一定的进展，其对于准确检测临床样品中的肿瘤标志物具有灵敏度高、检出限低、成本低、操作简单和反应快速等优点[20]。表1所示为常见的外泌体检测蛋白标志物及其在癌症检测中的临床应用[21-34]。

表1 常用的外泌体蛋白生物标志物及其临床应用Table 1 Common protein biomarkers of exosomes and their clinical application

本文作者从电化学、光学、声学三大原理出发，综述了近几年各类免疫生物传感器定量检测外泌体的作用机理、检测性能及检测应用等，并对免疫生物传感器的发展前景以及未来挑战进行探讨。

1.1 免疫检测原理

抗体是人体中一种由浆细胞分泌的具有免疫活性的蛋白质，由四条多肽链组成，属于免疫球蛋白(Ig)[35]。抗原是一类能刺激机体产生免疫反应的物质，机体的免疫细胞受到抗原刺激后，产生免疫应答，引发B淋巴细胞分化、分裂抗体。抗原具有免疫反应性，其通过抗原决定簇来刺激机体产生免疫应答以及与相应抗体结合。抗原决定簇是位于抗原表面的特定的化学结构，主要包括某些特定的化学基团以及特定的分子构象。

免疫检测技术即利用抗体-抗原之间的特异性结合而开发的技术，实质上是由于抗体和抗原之间存在结构互补性以及亲和性，抗体的铰链结构具有柔曲性，在与抗原结合时张合自如，抗原决定簇在抗体的可变区与抗原结合片段借助非共价相互作用力如氢键、静电作用力、范德华力、疏水作用力而结合在一起。在外泌体定量检测中，“抗原”主要是指外泌体的内容蛋白，包括四跨膜蛋白(CD9，CD63 和CD81)、热休克蛋白(HSP60，HSP70 和HSP90)以及具有较好特异性的癌症相关蛋白(CA125 和PSMA)等。近年来，基于免疫检测的技术由于其灵敏度和特异性高的优势，在外泌体蛋白标志物检测中得到了广泛应用。

1.2 基于免疫检测技术的生物传感器

生物传感器是一种利用物理化学传感原理检测生物活性元素的分析装置，待检测样本中的化学物质浓度通常与测量信号强度呈比例关系。生物传感器结构通常包含作为识别元件固定在传感器上的生物敏感材料、实现一种或多种分析物测量的理化换能器以及实现检测结果分析的信号处理装置[36]。生物传感研究始于1956年[37]，20世纪七八十年代，生物传感器迎来第一波研究热潮，多种物理化学原理的引入丰富了生物传感器的种类，如热生物传感器[38]、光纤生物传感器[39]、压电生物传感器[40]、表面等离子共振生物传感器[41]等等；
20世纪90年代，丝网印刷技术的发展促进了生物传感器的商业化进程；
1990年，有学者[42]提出了免疫传感器的概念，与此同时微流控芯片技术也开始应用于生物传感器领域；
21世纪初，纳米材料被广泛应用于生物传感信号的放大，基于纳米技术的生物传感器得到迅速发展，生物传感器进入纳米传感时代[43]。

生物识别元件的选择取决于识别元件与靶标之间的结合亲和力。免疫检测技术因其应用范围广、抗原抗体相互作用强而被广泛应用于生物识别领域，至今已有20 多年的历史。免疫生物传感器将免疫亲和技术与生物传感技术相结合，利用抗体作为生物识别分子固定在换能器表面上，换能器将生物识别分子与靶标相互作用产生的生化反应转换为可测量的信号，如电化学信号、光强度和质量变化等。电化学传感器通过电化学换能器将生物识别分子和生物标记物的相互作用转化为可测量的电化学信号，如电流、电势、电导、阻抗[44]等。光学传感器中的光学换能器则是利用光的吸收、荧光、表面等离子共振(SPR)和其他光学现象来检测目标信号[45]。基于质量的换能器通过检测质量变化来识别生物标志物，由于质量的变化，晶体的振荡频率也会发生变化，从而实现对生物标志物浓度的检测[46]。免疫生物传感器用于外泌体定量检测工作原理如图1所示，其检测结果可以用于癌症的诊断、预测以及预后。

图1 免疫生物传感器工作原理图Fig.1 Working principle diagram of immune biosensor

2.1 电化学免疫生物传感器

电化学免疫生物传感器结合了电化学分析技术与生物传感器技术，具有很高的灵敏度、选择性和检测能力，是至今研究和使用最广泛的生物传感器。根据电化学分析方法的不同分为循环伏安法(CⅤ)[47]、差分脉冲伏安法(DPⅤ)[48]、计时电流法(CA)[49]、方波伏安法(SWⅤ)[50]、交流阻抗法(EIS)[51]等等，其工作原理依赖于分析物和换能器的电化学性质，换能器和分析物之间的传感器表面发生电化学反应，产生电压、电流、阻抗和电容等可检测的电化学信号。电化学生物传感器通常采用三电极体系，即工作电极、参比电极以及对电极，参比电极的引入用以保证工作电极电势按照预定的电压变化，工作电极为固体电极，通常采用金[52]、碳[53]、氧化铟锡(ITO)[54-55]等材料，用于生物敏感材料固定以及待测物捕获。电化学生物传感器一般采用辣根过氧化物酶(HRP)标记目标生物分子，通过HRP 催化H2O2和3,3",5,5"-四甲基联苯胺(TMB)产生氧化还原信号，通过安培法检测并计算出待测物的浓度。

DOLDÁN 等[33]在丝网印刷金工作电极上利用11-巯基十一烷酸(MUA)的自组装单层(SAM)固定兔抗人CD9 抗体，用以亲和捕获外泌体；
以Ag/AgCl作为伪参比电极，利用HRP与CD9抗体形成夹心结构，基于TMB 的电化学还原反应，利用该生物传感器对超速离心分离的乳腺癌(MCF-7)细胞外泌体进行了检测与分析。只需要1.5 μL样品，该装置对于外泌体的检出限即可达到200 个/μL。CAO 等[56]应用放大方波伏安法(SWⅤ)检测肝癌细胞系HepG2 培养液中预先提取的外泌体。利用EDC/NHS 将通用型CD63 抗体共价连接在羧基化磁珠上，磁珠与外泌体在37 ℃下孵育1 h，将抗CD63抗体连接到羧化的免疫小球上后固定至金电极上，用以捕获外泌体。YADAⅤ等[57]先利用外泌体通用型抗体即四跨膜蛋白CD9 抗体捕获大量外泌体。由于人表皮生长因子受体2(HER2)对于乳腺癌有着良好的特异性，大量捕获外泌体后，使用癌症特异性抗体HER2作为二抗，对CD9抗体捕获的外泌体中的癌症特异性外泌体进行DPⅤ检测，仅需5 μL血清样本即可在2 h内实现检测，外泌体检出限约为105个/μL，整个过程在亲和素修饰碳电极作为工作电极、银电极作为对电极和参比电极的E-SPE 丝网印刷电极上进行，相较于ELISA 方法，大大减少了样本量及检测时间。

2016年，JEONG 等[32]利用电化学传感器易于小型化集成化的优势，提出了一种便携的基于集成的磁-电化学的传感器，这种便携的八通道设备(IMEX)采用8 个独立的通道，每个通道配备有恒电位仪，原理如图2(b)所示，由微控制器实现信号的输出、采集以及通讯功能，无需大量过滤或离心即可直接从复杂的培养基中分离出细胞特异性外泌体，将磁富集、抗体识别和酶信号放大与丝网印刷电极相结合，用于快速、现场筛选外泌体，检出限为3×104个/mL，约为ELISA 法的检出限的1/100。首先，将外泌体捕获到修饰有跨膜蛋白的免疫磁珠上，随后与生物素标记的抗体结合，利用链霉亲和素结合的HRP催化H2O2和TMB，产生氧化还原信号，在1 h 内同时分析4 个不同的标记物(CD63，EpCAM，CD24 和CA125)，与传统分析方法相比，磁-电化学传感器在分析灵敏度和速度方面表现更优，且可应用于卵巢癌患者血浆样品中的外泌体定量。

图2 集成磁电外泌体检测装置(iMEX)Fig.2 Exosome detection device integrated with magnetoelectricity(iMEX)

电化学生物传感器由于其低成本、响应快速、易于小型化等优点而被广泛应用于即时检测(POCT)，是目前应用最广的生物传感器，但是生物传感检测不同于仅需单步催化的葡萄糖检测，其过程复杂，容易产生背景干扰影响结果；
利用微流控技术，开发一款无需复杂的人员操作、集样品前处理和检测于一体且可实现检测自动化的设备将会有广阔的应用前景。

2.2 光学免疫生物传感器

近年来，光学生物传感器由于其突出的准确性和稳定性而受到广泛的关注[58]，光学免疫生物传感器利用抗体-抗原免疫结合形成复合物，导致换能器表面光学特性改变，利用光吸收、荧光、表面等离子共振(SPR)、表面增强拉曼散射(SERS)和其他光学现象来检测目标信号，由相应检测仪收集并转换为电信号进行数据处理。光学免疫生物传感器在生物检测中显示出巨大的优势，例如干扰少，灵敏度和特异性高，背景噪声信号低等，特别是可以通过测量来自多种分析物的不同波长信号实现多重检测[59]。

2.2.1 荧光生物传感器

荧光生物传感器通过荧光基团对生物活性元素进行荧光标记，以荧光信号为检测对象，在激发光源的照射下，不同荧光基团被激发出不同波长的荧光信号，通过观察荧光信号的强度对不同来源样品中的生物标志物进行定量分析。常见的荧光标记物主要有亲脂性的染料[60]、膜渗透型的化合物[61]、量子点标记[62]等等。这种类型的生物传感器因其具有高选择性、高灵敏度和响应时间短等优势，在医疗诊断、环境和食品质量监测中得到了广泛的应用。

WANG 等[63]结合锆离子和外泌体脂质中的磷酸盐的固有特性，通过引入钙黄绿素修饰的脂质体实现信号放大，形成外泌体-锆离子-脂质的夹心结构用于外泌体的检测，Zr4+通过静电相互作用与磷脂膜的磷酸基团结合，在外泌体与脂质体之间起连接作用，钙黄绿素产生荧光信号，荧光信号强度与外泌体浓度成正比。利用磁珠与CD63偶联用于外泌体的捕获，通过磁分离去除未结合的脂质体和其他潜在的信号干扰。HE 等[64]设计了含有交叉通道的微流控芯片，可以实现不同液体的注入与混合，如图3(a)所示。预先将标记好抗体的磁珠与血浆样本混合，对外泌体进行免疫捕获，通入1 号口，引入第一腔室，利用磁力保留外泌体，利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，片上外泌体被裂解而释放蛋白质，利用磁珠免疫将蛋白质沉淀于第二腔室，该芯片能够从血浆样品中分离和富集外泌体，利用荧光检测技术完成靶外泌体表面蛋白的原位测量。利用该技术分析了2例肺癌患者、2 例卵巢癌患者和3 例健康对照者的外泌体表面蛋白的含量，发现癌症患者的表面蛋白EpCAM，IGF-1R，CA125，CD9 和CD81 的含量明显比正常人的高。为了实现大样本量以及多重生物标志物的检测，ZHAO等[65]改进了微流控芯片的设计，如图3(b)所示。利用片上连续混合替代片外磁珠与血浆样本的孵育，提高了可同时处理的血浆样本的能力，改进后的芯片检测灵敏度提高了10 倍，检测时间也显著缩短。BAI 等[62]开发了一种用于分离外泌体和检测多重肿瘤标志物的基于微珠的微阵列芯片，在同一芯片上设置并行四通道实现联合检测。在微珠表面固定CD9 抗体以捕获外泌体，通过微流控芯片实现微珠的捕获，并通过标记有CEA，Cyfra21-1 和ProGRP 抗体的量子点(QD)探针检测外泌体上的肿瘤标志物。利用这种方法实现了3 种肺癌相关标志物的多重检测，结果表明，不同的肺癌细胞显示出明显不同的标志物表达水平，根据不同表达情况可以在一块芯片上初步实现对肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌这3种肺癌的分型。该设计可为外泌体肺癌标志物检测和早期癌症诊断提供参考。

图3 荧光生物传感器的应用实例Fig.3 Applications of fluorescent biosensors

荧光生物传感器因其与多重传感技术的兼容性以及其在微流控系统中的集成性而被广泛用于肿瘤标志物的检测，但是，其依赖光谱仪以及外界光源作为激发介质，对光路的精密性要求极高，且检测过程中存在荧光染色影响结合以及光猝灭等问题。

2.2.2 表面等离子共振生物传感器

表面等离子共振(SPR)生物传感器的原理如下：当偏振光以临界角入射到2种不同折射率的介质界面时，在一定角度会产生电子电荷密度波，称为等离子体波。由于入射光子和金属表面的电子相互作用，引起金属薄膜内自由电子的共振，导致反射光相对于入射光以特定的共振角衰减，当表面介质的属性改变或者附着量改变时，引起共振角发生规律的变化。通过监测生物反应过程中共振角的动态变化，可实现生物分子之间结合和相互作用的特异性信号分析。

为了实现多路传感，ZHU 等[66]将SPR 成像与抗体微阵列结合，可同时定量多种外泌体跨膜蛋白，将人肝癌细胞(MHCC97H)分泌的外泌体与固定于金表面的CD9，CD41b，CD63，CD82 和EpCAM抗体共孵育，激光的光路以固定的入射角通过耦合棱镜，微阵列抗体捕获外泌体后，影响折射率，从而改变反射的激光强度，由CCD 摄像机记录反射信号，检测原理简图见图4。SINA等[67]在玻璃晶片上先后沉积厚度分别为5 nm 和50 nm 的Ti 和Au，形成SPR 传感器芯片，利用生物素与链霉亲和素相结合的方法将人体表皮生长因子受体抗体(anti-HER2)固定于芯片表面金层，采用试剂盒提取乳腺癌(BT474)细胞培养上清液中的外泌体，利用SPR 检测无需二抗标记的优势，缩短了测定时间，其检出限与现有常规技术的检出限相当，为8.28×104个/μL。

图4 SPR生物传感器原理图Fig.4 SPR biosensor principal diagram

相较于荧光检测技术，表面等离子共振技术是一种实时、无标记的生物传感器，具有灵敏度高、检测时间短的优点，因此得到了迅速发展。然而，现有的研究中，大多数生物传感器仅用于检测已分离的外泌体样本，需要超速离心等复杂的前处理步骤，且不支持多指标检测，当外泌体双层膜结构发生改变时，折射率发生改变进而影响检测的准确性。

2.2.3 表面增强拉曼散射生物传感器

表面增强拉曼散射(SERS)生物传感器的原理如下：在金属纳米粒子上修饰拉曼分子(称为SERS探针)，利用抗体-抗原-SERS 探针形成三明治复合结构，通过拉曼分子提供拉曼信号，抗体-抗原与探针结合越多，拉曼分子的数量也越多，产生的拉曼信号也越强，通过拉曼信号的检测，可实现肿瘤标志物的定量检测。

ZONG 等[30]利用纳米磁珠、SERS 探针以及人乳腺癌SKBR3 细胞分泌的外泌体表面CD63 和HER2蛋白形成三明治夹心结构。利用磁力作用将磁珠进行沉淀，在沉淀物中检测SERS信号，在无外泌体靶蛋白情况下，无免疫结合，沉淀物均为磁珠，SERS信号弱，2 h内可实现外泌体的捕获以及检测。KWIZERA等[28]采用金纳米棒代替球型金纳米粒子，利用17×5 的阵列结构，将抗体固定于芯片表面，定量测量了来自乳腺癌细胞和HER2阳性乳腺癌患者的外泌体表面蛋白，在2 h内分析超过80 种样本，该方法可以降低成本，实现多重检测，提高检测效率。

与表面等离子体共振或荧光生物传感器相比，表面增强拉曼散射生物传感器可以在复杂多变的生物环境中识别独特的光谱信号。为了提高SERS生物传感器的灵敏度，必须对SERS探针进行合理的设计以及优化，故其商业化还需要时间。

2.3 声波免疫生物传感器

声波免疫生物传感器根据使用的换能器类型可分为石英微量天平(QCM)和声表面波(SAW)传感器。压电晶体在施加电场时会以特定的频率振荡，晶体发生弹性变形，当固定在压电晶体上的生物识别分子与目标结合时，传感器表面质量和界面特性改变，引起晶体的振荡频率和相位变化。通过测量声波频率和相位的变化，可实现定量检测生物标志物浓度的过程。

自20世纪70年代以来，声波传感器发展迅速，声波免疫生物传感器在肿瘤标志物(如PTHrP[68]，PSMA[69]，CEA[70]和CTnl[71])的检测中取得了一定的进展。SUTHAR 等[72]通过监测石英微量天平(QCM)的耗散，利用CD63抗体免疫结合将外泌体固定于换能器界面，实现对人体血清外泌的体定量检测，外泌体最低检出限可达到1.4×108个/mL。声表面波是一种沿基底表面传播的弹性波，用于生物传感器的声表面波有水平剪切声表面波和勒夫波两种类型[73]。声表面波传感器结构一般由基片、波导层和叉指电极组成。WANG等[74]将声表面波传感器与AuNPs 扩增相结合，建立了一种可靠、高效、经济的外泌体检测方法。为了放大检测信号，将生物素偶联的上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体和AuNPs 标记的链霉亲和素均应用于结合外泌体的SAW 芯片，从血液样本中提取外泌体并将其应用于CD63 修饰的SAW 芯片后，将从健康志愿者样本中获得的响应信号与从肺癌患者中获得的响应信号进行比较，发现信号蛋白表达水平存在差异，该方法对于外泌体的检出限可以达到1.1×103个/mL。然而，由于CD63在不同癌症的外泌体中广泛表达，该生物传感器不能区分不同类型的癌症患者。

声波生物传感器是近年来迅速发展起来的一种新型生物传感器，因其无需标记物以及探针、操作简单、可以实时测量等优势在生物检测领域引起了极大的关注，有望实现外泌体的高灵敏检测。然而，其发展仍然面临着许多困难和挑战。首先，用于制造声波生物传感器的压电材料有待开发；
其次，无标记检测会带来非特异性结合的问题，从而影响检测结果。

2.4 对比总结

对生物传感器的关键参数，如靶标、样本及样本量、检出限、检出时间等进行对比，结果见表2。由表2可以看出：目前生物传感器在特异性、样本量、检出限以及检测时间方面比纳米颗粒跟踪分析(NTA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹(WB)这3 种定量方法表现更优，且联合多种外泌体蛋白标志物可实现癌症的特异性检测，具有广阔的应用前景。

表2 定量检测外泌体的生物传感器参数对比Table 2 Parameter comparison of biosensors for the detection of exosomes

肿瘤细胞分泌的外泌体广泛分布于体液中，已经成为癌症早期诊断的有利工具。在外泌体的定量检测方法中，基于抗体抗原的免疫生物传感器可以实现高敏感度、高特异性和非侵入性的早期癌症诊断。本文综述了近年来电化学、光学、声学免疫生物传感器在外泌体定量检测中的研究进展及其优缺点，已有的研究结果表明免疫生物传感器能够提供高灵敏度、高特异性、低检出限的检测，并证明了生物传感器在临床环境中的可行性。未来生物传感器的发展趋势还应关注以下几个方面：

1)目前医院肿瘤标志物的检测仪以大型化学发光仪为主，仅适用于大型医院，急需开发可应用于检验科的小型化、便携化肿瘤标志物检测仪。微流控技术得益于其高通量、小样本量，且在微通道中实现生物传感速度更快等优势，被广泛地应用于生物传感器集成，从而改善了生物传感器的整体性能，微流控技术和生物传感器技术的集成为即时检测(POCT)提供了新的机遇和希望。

2)生物识别分子与生物标记物相互作用产生的微弱信号会导致检测灵敏度降低，故生物传感器的灵敏度仍有待提高。近年来，纳米材料被广泛应用于生物传感器中，如纳米粒子、碳纳米管、半导体量子点、氧化石墨烯等等，为生物传感器的研究增添了活力。

3)抗体存在制备困难且对温度敏感、难于存活等缺点，故一种新型的分子识别元件适配体受到广泛关注，其成本低和易合成的优势给分子识别领域带来一次重大变革。随着体外筛选技术(SELEX)的进步，适配体在基础科研、临床诊断和治疗中有着广阔的应用前景。

4)目前外泌体的定量检测仍缺乏临床验证，且其与癌症的准确定量关系仍未建立，利用多标志物同时检测有望提高检测的特异性，随着研究的深入，外泌体有望成为高灵敏度的常规临床诊断的检测标志物。

在大健康时代的驱动下，生物传感器将朝着高度智能化、集成化、微型化方向发展。