广西烟草棒孢霉叶斑病菌鉴定及毒素蛋白亚型检测

雷雪梅，桑维钧*，李昊熙，卢燕回，王五权，孔 菲，安宣鲜，杨茂发

(1.贵州大学 烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室,贵州 贵阳 550025；
2.中国烟草总公司 广西壮族自治区公司烟叶处,广西 南宁 530023)

烟草棒孢霉叶斑病最早于1973年在尼日利亚发现[1]。我国棒孢霉属病菌引起的烟草叶斑病于1998年在贵州发现，烟草棒孢霉叶斑病菌鉴定为多主棒孢霉Corynesporacassiicola[2-3]。2012年在广西首次发现烟草棒孢霉叶斑病，其病原菌鉴定为多主棒孢霉[4]。2015年进行了广西烟草棒孢霉叶斑病菌室内杀菌剂筛选[5]，之后有研究发现咪鲜胺、氟啶胺对广西烟草棒孢霉叶斑病的抑菌效果较好，且该病菌对QoIs类杀菌剂有耐药性，但抗性相关的位点未出现Cytb基因突变[6]。烟草棒孢霉叶斑病主要危害中下部叶片，高温高湿的气候会促进该病害的发生与蔓延，其菌丝生长、分生孢子萌发和产孢的最适温度范围在25～30 ℃之间[7-8]。发病叶片采烤后质量下降，直接影响经济效益[9]。

多主棒孢霉寄主广泛，可侵染530余种植物[9]，其中包括烟草[2]、橡胶[10]、香蕉[11]、草莓[12]、莲藕[13]、茄子[14]、苦瓜[15]和黄瓜[16]等，该病原菌代谢产物中具有某种致病因子[17]。2000年Breton等[18]研究发现多主棒孢霉可以合成一种蛋白质毒素“Cassiicolin”。经过试验进一步推测毒素蛋白与多主棒孢病菌的致病性有关[19-20]，Barthe等[21]对侵染橡胶的多主棒孢Cassiicolin毒素蛋白及其结构进行了分析。研究发现该病菌具有7种毒素蛋白(Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6和Cas7)并开发出毒素类型的特异性引物检测方法，将检测不到任何Cassiicolin毒素的基因划分为Cas0型[22-25]。该毒素蛋白与致病性相关，因此明确其毒素亚型对了解多主棒孢霉的生物学功能有重要意义，同时可为科学防治棒孢霉叶斑病奠定基础。

多主棒孢霉的Cassiicolin毒素亚型，目前的研究多集中于橡胶树的落叶病上，近年广西苦瓜棒孢霉叶斑病上也有研究，而烟草上还未见报道。本文对广西烟草棒孢霉叶斑病菌进行鉴定并测定其毒素类型，对比橡胶等其他作物上多主棒孢毒素类型的异同，这对了解多主棒孢霉的遗传进化关系和对烟草棒孢霉叶斑病的防治具有重要意义。

1.1 材料

1.1.1病叶样本采集

2021年4—7月，分别在广西壮族自治区贺州市(24°41′N,111°57′E)钟山县公安镇、富川瑶族自治县富阳镇、朝东镇、石家乡、新华乡，百色市(23°90′N,106°62′E)靖西市新靖镇、化峒镇、地州镇、同德乡、隆林各族自治县德峨镇、蛇场乡，河池市(24°70′N,108°09′E)南丹县六寨镇、八圩瑶族乡等烟区采集烟草棒孢霉叶斑病的病叶样本。

1.1.2供试培养基

采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，青岛海博生物技术公司)。称取46 gPDA培养基，加去离子水定容至1 L，经121 ℃高压灭菌30 min后备用。

1.1.3供试植物

广西贺州烟区主栽烟草品种K326；
其他寄主植物(橡胶、黄瓜、苦瓜、番茄、香蕉)。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分离与纯化

在实验室对病原菌进行常规组织分离、单孢纯化[26]。选取病斑清晰的烟草叶片，利用灭菌后的手术剪在无菌操作台中剪取病健交界处约0.5 cm×0.5 cm病叶组织，用75%乙醇浸泡3～5 s，然后用无菌水清洗3～5次，转接于PDA培养基平板上，28 ℃培养。待菌落长出后，在菌落前缘挑取少量菌丝转接到新的PDA平板上，通过2～3次转接后，将菌落后纯化。将纯化的病原菌转接到PDA试管斜面，4 ℃保存备用。同时采用5 mm直径打孔器打取菌饼，保存在1 mL的40%无菌甘油冻存管中，-20 ℃保存[27]。图1为烟草棒孢霉叶斑病田间症状图，与关国经等[2]、张中义等[3]的症状描述一致。

图1 烟草棒孢霉叶斑病田间症状图Fig.1 The symptom of tobacco Corynespora leaf spot(a and b)

1.2.2病原菌诊断

将分离纯化的菌株接file:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/SDNS202301/SDNS202301/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F.ebook/images/3bb00483a95be371416a443576906f39.jpg种于PDA平板上(90 mm培养皿，15 mL培养基)，每个培养皿接种1个菌饼于PDA平板中央，每个菌株3个重复，黑暗条件、28 ℃恒温下培养8 d，观察菌落的形状、颜色等[4,28]。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的DNA提取试剂盒提取病原菌DNA，再利用核糖体转录间隔区(ITS)[29]、翻译延伸因子(EF-1α)[30]、β微管蛋白(TUB)[31]等多基因的引物序列对病原菌目的基因进行PCR扩增。将扩增成功的样品送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。参照GenBank数据库分析病原菌信息。

1.2.3病原菌毒素蛋白亚型鉴定

利用毒素亚型的特异性引物(表1)进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将扩增成功的样品送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果进行BLAST比对分析。

表1 本研究所用鉴定毒素亚型引物信息(Déon[32-33],2012年)Tab.1 Primer information for identifying toxin subtypes used in this study (Déon[32-33],2012)

1.2.4致病性分析

根据毒素类型鉴定，选取本研究中不同毒素类型的代表菌株进行致病性分析。2022年3月将健康的K326烟草、橡胶、黄瓜、苦瓜、番茄、香蕉移栽至广西壮族自治区贺州市富川瑶族自治县福利镇试验基地。每种移栽植物30株，待植物叶片长至6～8片时进行室外活体接种。在经过黑暗条件、28 ℃恒温下培养了7 d的PDA平板，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼。将菌饼倒置在健康的叶片上，对照作物接同样大小的新鲜PDA培养基，覆保鲜膜保湿。每个处理3个重复。接种7 d后观察发病情况。待叶片发病后观察发病症状，并重新分离病原菌，经形态学鉴定发现其特征与本研究的菌株一致。

2.1 病原菌的分离与纯化

从广西壮族自治区烟草种植区分离纯化得到15株病原菌，保存于贵州大学烟草学院烟草病害研究室，菌株相关信息如表2所示。

表2 本研究病原菌信息Tab.2 Pathogen information of this study

2.2 病原菌诊断与回接验证

在PDA培养基上的菌落正面为青灰色，菌丝紧密呈绒毛状(图2-a)，菌落边缘呈灰白色；
背面以黑青、褐青色为主(图2-b)。对15株病原菌进行孢子形态观察，孢子呈棒状，一端略细，直径为(29.44～63.26)μm×(5.53～10.14)μm(图2-c、2-d)。且经回接烟草证明具有致病性，初步鉴定15株病原菌为多主棒孢霉。

注：a.菌落正面；
b.菌落背面；
c.孢子；
d.分生孢子梗。图2 病原菌形态学鉴定Fig.2 Morphological identification of pathogenic bacteria

利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物对病原菌目的基因进行PCR扩增，将测序结果进行BLAST比对分析，发现15个菌株与GenBenk里的多主棒孢霉具有99 %以上的同源性。将15个菌株的序列上传GenBank，登录号如表3所示。将15个病原菌与GenBank中的棒孢属菌株和以链格孢菌CAU8331为外群构建系统发育进化树(图3)。本研究病原菌与C.cassiicola聚于一个分支上，因此，确定本研究15个病原菌为C.cassiicola。

表3 本研究病原菌GenBank登录号Tab.3 The landing number of the pathogen GenBank in this study

图3 基于rDNA-ITS、TUB、EF-1α序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS,TUB and EF-1α sequences

将该病原菌接种到烟草叶片上，4 d后叶片接种部位变黑，周围褪绿变黄明显(图4-a)，产生的病斑形态与田间症状也十分相似。从接种发病的叶片中再次分离得到菌株，发现与原接种菌株相同，说明该菌株为致病菌。空白对照无发病迹象(图4-b)。

注：a.菌饼无伤接种4 d症状；
b.空白对照PDA接种4 d症状。图4 病原菌回接症状图Fig.4 Symptom of pathogen reconnection

2.3 病原菌毒素蛋白亚型鉴定

利用毒素亚型的特异性引物与CasF15和CasR28进行PCR扩增，结果发现在用6种特异性引物时，本研究菌株均无条带；
用CasF15和CasR28时只有一个菌株(CBJT)有条带，条带大小500 bp左右，其他菌株均无条带(图5)，初步认定为多主棒孢霉菌不产生毒素的亚型Cas0。将扩增出的样品送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果进行BLAST比对分析，发现与Cas7亚型是100%同源性。因此，本研究15个多主棒孢霉菌株中，14个菌株毒素蛋白亚型为Cas0，1个菌株毒素蛋白亚型为Cas7,且已将Cas7序列上传至GenBank，登录号为ON803445。

注：M为Marker;8为Cas7基因PCR产物。图5 电泳凝胶成像图Fig.5 Electrophoretic gel image

将本试验中含Cas7毒素的菌株CBJT与GenBank中22个已鉴定的来自不同国家、不同作物、不同毒素亚型的多主棒孢霉菌株，利用毒素基因序列构建ML系统发育树(图6)。从图6可看出相同毒素亚型的多主棒孢霉菌分别聚在一支，其中来自黄瓜、橡胶、马缨丹寄主的Cas2亚型多主棒孢霉菌聚在一支；
来自橡胶寄主的Cas1、Cas3、Cas4、Cas5的多主棒孢霉菌分别各聚一支；
来自大豆寄主的Cas6亚型多主棒孢霉菌聚在一支；
本试验含Cas7毒素的菌株CBJT与来自黄瓜寄主的Cas7亚型多主棒孢霉菌聚在一支。

图6 部分烟草多主棒孢霉菌株Cassiicolin基因系统发育树分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the Cassiicolin precursor genes from C.cassiicola isolates of tobacco

2.4 病原菌致病性分析

通过对病原菌毒素蛋白亚型的鉴定，选取了Cas0亚型的两个代表菌株CZFX-2、CHNL-2和Cas7亚型的菌株CBJT进行致病性分析试验。由表4可知，Cas0、Cas7亚型均可侵染烟草K326、橡胶、黄瓜、苦瓜、番茄，不能侵染香蕉。结果表明虽然毒素亚型不同，但对本研究中的烟草K326、橡胶(海垦6号、海垦1号)、黄瓜、苦瓜、番茄等作物均有致病性，对香蕉(金粉1号、桂蕉6号)无致病性。

表4 病原菌致病性分析Tab.4 Pathogenicity analysis of pathogenic bacteria

注：a、b、c、d、e、f、g、h分别为菌株CHNL-2无伤接种烟草、番茄、黄瓜、苦瓜、香蕉(金粉1号)、香蕉(桂蕉6号)、橡胶(海垦6号)、橡胶(海垦1号)7 d症状；
i、j、k、l、m、n、o、p分别为菌株CZFX-2无伤接种烟草、番茄、黄瓜、苦瓜、香蕉(金粉1号)、香蕉(桂蕉6号)、橡胶(海垦6号)、橡胶(海垦1号)7 d症状；
q、r、s、t、u、v、w、x分别为菌株CBJT无伤接种烟草、番茄、黄瓜、苦瓜、香蕉(金粉1号)、香蕉(桂蕉6号)、橡胶(海垦6号)、橡胶(海垦1号)7 d症状。图7 病原菌致病性测定Fig.7 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria

本研究利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物对病原菌进行系统分析，确定了广西烟草棒孢霉叶斑病病原菌是多主棒孢霉。该病具体分布区域包括贺州市钟山县(公安镇)、富川瑶族自治县(新华乡)，百色市靖西市(新靖镇、化峒镇、同德乡)、河池市南丹县(六寨镇)，与谭海文等[4]的研究相比病害发生区域增多。

目前国内多主棒孢霉菌仅存在Cas2和Cas5这2种Cassiicolin毒素亚型，和未检测到毒素的Cas0亚型。从我国橡胶分离的多主棒孢霉的毒素类型主要是Cas2、Cas5与未检测到毒素的Cas0亚型[34]；
从黄瓜、苦瓜等葫芦科寄主上分离的多主棒孢霉毒素亚型主要是Cas2和未检测到毒素的Cas0亚型[35]。上述不同毒素亚型的多主棒孢霉菌能否侵染烟草未见报道。本研究首次测定了广西15个多主棒孢霉菌株的Cassiicolin毒素亚型，其中14个菌株是Cas0亚型，1个菌株是Cas7亚型。此前我国有关多主棒孢霉菌Cassiicolin毒素亚型的研究未见在烟草上报道，且我国此前也没有Cas7毒素亚型的报道。本研究测定结果表明，目前广西烟草棒孢霉病菌中无毒素亚型(Cas0)为优势群体，这种亚型分布在百色市靖西市(化峒镇、新靖镇)，贺州市富川瑶族自治县(新华乡)、钟山县(公安镇)，与河池市南丹县(六寨镇)。Cas7亚型菌株出现在百色市靖西市(同德乡)。推测烟草上多主棒孢霉的毒素亚型不存在地区差异。此外，本研究从广西烟草上分离到的Cas0、Cas7毒素亚型菌株可以侵染烟草，也可以侵染橡胶(海垦6号、海垦1号)、黄瓜、苦瓜、番茄。但是对香蕉(金粉1号、桂蕉6号)不致病。因此推测除毒素外还存在其他致病因子。

本研究结合有关参考序列，进行了病原菌的遗传关系分析。结果表明烟草棒孢霉叶斑病菌存在遗传分化，相同毒素类型的菌株分别聚在一支，与Déon等[22]、刘先宝等[36]研究结果一致。本研究鉴定了广西烟草棒孢霉叶斑病病原菌并首次测定报道烟草棒孢霉病菌的毒素亚型，为该病害的科学防治提供理论基础。