线粒体D-Loop区单核苷酸多态性与喉癌发病风险关系的研究

程洪坤，赵瑞力*，李 琳，徐玉茹，胡国斌，兰利利

(1.河北省邯郸市眼科医院耳鼻咽喉科，河北 邯郸 056000；
2.河北医科大学第四医院急诊科，河北 石家庄 050011；
3.河北医科大学第四医院耳鼻咽喉头颈外科，河北 石家庄050011)

喉癌(laryngeal carcinoma)是耳鼻咽喉-头颈外科常见的恶性肿瘤之一，每年在全世界造成8.3万人死亡，其中绝大多数为男性，死亡人数为7.3万[1]。喉癌中最常见的病理类型为喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)，约占所有喉癌类型的90%[2]。近年来，人类粗放式发展经济，造成大气污染、城市人口的大量增加，人类生存环境的逐步恶化，从而导致我国北方喉癌的发病率逐年增加。与甲状腺癌、头颈皮肤癌等癌症不同，喉癌早期症状并不典型，患者初次就诊多处于喉癌的中、晚期。另外，喉是一个特殊器官，负责机体发音、呼吸并协助吞咽，中晚期LSCC患者需采取手术治疗部分甚至全部切除喉体，术后可能发生咽瘘、喉瘘，可能需要长期佩戴气管套管，甚至丧失发音功能，无论身体还是精神上均给患者带来巨大创伤。因此喉癌的早诊早治直接影响了喉癌患者术后生存质量，这就要求我们深入了解喉癌的发病机制，寻找有效的早期预测LSCC发病的指标。人类线粒体DNA(mtDNA)是哺乳动物细胞内唯一的核外遗传物质。多项前期研究显示，人类的衰老、神经退行性疾病、糖尿病以及肿瘤等多种疾病的发生均与可能人体mtDNA氧化损伤相关[3]。本研究所涉及D-Loop区是mtDNA的非编码区，包含复制的起始点和转录启动子，控制着整个mtDNA的复制和转录过程，成为近年来研究mtDNA突变与多态性的热点区域[4]。因为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)在多基因疾病的易感基因研究领域广泛应用。SNPs已然成为继限制性片断长度多态性(restrictive fragment length polymorphism，RFLP)标志和微卫星标志后的第3代遗传标志。多项国内外研究发现，线粒体D-Loop区的单核苷酸多态性改变与包括食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的发病和预后有关[5-8]。本课题旨在探讨LSCC发病与线粒体D-Loop区的单核酸多态性改变的关系，希望能够找到预测因子，从而提高LSCC患者的早诊早治，改善LSCC患者术后生活质量。

1.1一般资料 病例组选取接受喉部分切除术或喉全部切除术的患者71例，均在河北医科大学第四医院耳鼻咽喉-头颈外科住院，住院日期在2013年6月1日—2016年11月30日。病例组患者均为男性，年龄39～73岁，平均(53.2±8.1)岁。由该院病理科两名以上病理诊断经验丰富的医生诊断，确认术后标本为LSCC。病例组患者的临床资料除年龄及抽烟史[每日抽烟支数×烟龄(年)>400]外，还包括喉肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤临床分型、淋巴结转移及国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)TNM分期情况(2002版)等。另外，对照组选取2012年2月1日—2013年8月31日在该院体检中心行健康查体的人群159例，其中男性97例，女性62例，年龄40～64岁，平均(52.1±7.8)岁。标本均为空腹外周静脉血，取材后即刻放入-4 ℃冰箱恒温保存。

标本采集过程取得病例组和对照组研究对象的知情同意，并经医院伦理委员会批准同意。

1.2研究方法

1.2.1mtDNA提取及聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增 实验采用北京天根生化科技有限公司生产全血线粒体萃取试剂盒线粒体DNA的提取试剂盒，线粒体DNA提取后迅速置入-80 ℃恒温冰箱保存。标本mtDNA的D-Loop区的扩增采用PCR法。标本mtDNA的D-Loop区扩增的上游引物为5′-CCCCATGCTTACAAG-CAAGT-3′，标本mtDNA的D-Loop区下游引物为5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′，mtDNA的D-Loop区扩增的目的片段长度为982 bp。上海生物工程技术服务有限公司完成本实验标本mtDNA的D-Loop区上、下游引物的合成和纯化。反应程序程序如下：95 ℃预变性2 min，95 ℃变形30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38个循环，最后于72 ℃延伸5 min。

1.2.2线粒体DNA测序及结果分析 委托北京中科希林生物科技有限责任公司对PCR反应产物纯化及扩增，对纯化后的PCR扩增产物使用ABI PRISM 3730xl测序仪进行基因测序，采用双向、测通、重复测序对同一标本进行检测。本研究医用DNAMAN测序分析及Chromas软件对病例组及对照组的mtDNA D-Loop区序列进行分析，将分析结果与人mtDNA文库记录的剑桥序列(revised cambridge reference sequence，rCRS)进行比对，从而筛选出病例组及对照组mtDNA D-Loop区的SNPs。

1.3统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。喉癌组与对照组的D-Loop区变异及临床特征的比较采用χ2检验，当理论频数T≥5时，用χ2检验专用公式，当1≤T<5 时，用χ2检验连续校正公式，当T<1时，用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1研究对象的一般特征 将喉癌组与对照组的性别、年龄、吸烟史进行比较，结果显示病例组男性多见，吸烟的喉癌发病率显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)。比较病例组与对照组间<40岁与≥40岁的分布频数，差异无统计学意义(P>0.01)，见表1。

表1 喉癌组与对照组临床特征Table 1 Comparison of general characteristics between case group and control group (例数)

2.2mtDNA D-Loop 区SNPs与喉癌发病风险的关系 研究剔除了mtDNA D-Loop 区SNPs最小等位基因频率<5%的位点，获得共25个单核苷酸多态位点，并对之进一步分析。采用χ2检验比较病例组与对照组mtDNAD-Loop区SNPs的分布频率，实验发现多达9个多态性位点与LSCC发病相关，包括73G/A、309C/Cinsert、315C/C insert 、524C/del、556A/del、16288T/C、16291C/T、16311T/C及16319G/A。进一步分析表明。LSCC发病风险的提高可能与73G、309C、315C及16319G相关，而LSCC发病风险的降低可能与524C、556A、16288T、16291C及16311T相关。见表2。

表2 病例组与对照组单SNPs位点的频数差异Table 2 SNP sites showing frequency difference between case group and control group (例数，%)

2.3与LSCC发病相关的 SNPs与临床特征的关系 分析比较LSCC相关的SNPs位点与患者的临床特征的关系，结果显示相较于有淋巴结转移组16291C基因型分布频率(62.5%)，该基因型在无淋巴结转移组的分布频率(96.4%)较高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。将病例组LSCC发病相关SNPs与其他临床特征(肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤临床分型、淋巴结转移情况及TNM分期)相比较，结果显示上述临床特征与病例组喉癌发病相关SNPs无关，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 LSCC患者16291位点多态性与临床特征的关系Table 3 The relationship between 16291 locus polymorphism and clinical characteristics in patients with laryngeal squamous cell carcinoma (例数，%)

表3 (续)

人类的线粒体DNA为双链闭合分子结构，含有16 569个碱基，其中包括2种核糖体RNA基因，13种多肽编码基因以及22种转运RNA基因，它的产物参与构成电子传递链复合体及氧化磷酸化过程，还在线粒体内蛋白质的合成方面有着重要作用[9]。线粒体D-环区(D-Loop区)处于线粒体DNA 16024bp-576bp之间，长度为1 122 bp，国内外多项研究发现胃癌、食管癌、淋巴瘤及卵巢癌与mtDNA突变及多态性相关，而线粒体D-环区是线粒体DNA突变与多态性发生的热门研究区域[10-13]。线粒体D-环区的突变与多态性改变诱发肿瘤的发生，可能与抑制细胞电子传递的过程，超阈值释放大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)有关[14]。

本研究通过对71 例喉癌患者及159例正常人群静脉血标本的mtDNA测序分析，共发现了146个多态性变异，其中25个为高频率多态性变异位点。对这25个多态位点进一步分析，结果发现了9个多态性位点(73G/A、309C/Cinsert、315C/C insert、524C/del、556A/del、16288T/C、16291C/T、16311T/C及16319G/A)与喉癌的发病风险可能相关，73G、309C、315C及16319G基因型可能增加了喉癌的发病风险，而524C、556A、16288T、16291C及16311T基因型可能是正常基因表型。A-G与T-C的单个碱基替换的变异发生在多态位点73、16288、16291、16311及16319，而单碱基插入的变异形式发生在多态位点309与315，单碱基缺失则发生在多态位点524、556。本研究发现，与LSCC发病相关的多态性位点中16288、16291、16311及16319位点位于高变1区(HV1，16 024～16 324 bp)，73、309、315位点位于高变2区(HV2，63～322 bp)，而524及556位点位于高变3区(HV3，438～574 bp)，以上的多态性位点全部位于mtDNA的D-Loop区的高变区。在其他肿瘤中，如肺癌、胃肠胰神经内分泌肿瘤、白血病及肝癌发病和预后相关的多态性位点多数也分布在线粒体D环区这三个高变区中，表明线粒体D环区的高变1区(HV1，16 024～16 324 bp)、高变2区(HV2，63～322 bp)、高变3区(HV3，438～574 bp)是发生多态性改变的热点区[15-18]。这三个高变区域的基因突变有可能影响mtDNA复制并导致氧化呼吸链的改变，进一步导致细胞内大量ROS自由基释放而损伤细胞核基因组，从而在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。

此外，本研究结果与国内外相关研究结果呈一致性，如一些多态性位点改变不仅与LSCC发病相关，与其他类型肿瘤(如胃癌、食管癌、肾癌及淋巴瘤等)的发病也有一定的关系。Wang等[5]研究发现，胃癌的发病与mtDNA中D-loop区73位点、309位点及524位点的多态性相关。Fan等[19]研究发现mtDNA中D-loop区315位点的多态性与非霍奇金淋巴瘤的发病年龄相关。Zhang等[20]在肾癌方面的研究发现mtDNA中D-loop区16319位点的多态性与之相关。长远规划来看，若参考结合其他恶性肿瘤分子研究中建立的以mtDNA D-Loop区SNPs分析为平台的经验，可以建立针对LSCC早期诊断系统，从而提高LSCC肿瘤的早诊早治率，也为LSCC的后续的精准治疗提供有价值的靶点。其中D310区为位于线粒体D环区的高变2区303～315 bp的多聚胞嘧啶区，该区域变异形式以插入、缺失及单碱基重复为主。相较于其他区域，D310区更容易遭到氧化损伤，DNA聚合酶γ控制着线粒体DNA的复制，当损伤影响到4个核苷酸以上复制的忠实性，DNA复制出现滑动性错误，poly C序列就会发生多态性变异，此变异发生影响了线粒体的电子的传递，进一步导致细胞内大量活性氧自由基释放而损伤细胞核基因组，导致肿瘤发生[21]。本研究同时发现，16291C基因型在无淋巴结转移组中的分布频率较有淋巴结转移组高，其他与喉癌发病相关的SNPs与肿瘤的大小、肿瘤分化程度、肿瘤临床分型、淋巴转移及肿瘤TNM分期等无关，提示16291C可能是LSCC的一个保护性基因型。由于本研究样本量较小，明确相关性需增加样本量以进一步研究。

综上所述，本研究进一步阐述了LSCC的发病机制，筛选了预测LSCC发病的特异性生物标志物，有望提高患者的早诊早治率，改善患者术后生活质量，也为LSCC后续的基因治疗提供了有价值的靶点。