刺梨乙醇提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用及分子作用机制

董师宇，赵帅，易俊洁，蔡圣宝

昆明理工大学 食品科学与工程学院，云南 昆明 650500

随着国民生活水平的提高和饮食结构的变化，由嘌呤代谢紊乱引起的高尿酸血症人群的数量正逐年增加[1]。我国高尿酸血症人数已超过1.7亿，且以9.7%的年增长率迅速增加[2]。高尿酸血症的典型表现是尿酸(UA)含量升高，这会导致痛风、慢性肾脏疾病、高血压、糖尿病、溶血性疾病、动脉粥样硬化等[3]。UA是由关键酶黄嘌呤氧化酶(XOD)催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成的[4]，因此，抑制XOD活性是缓解高尿酸血症的主要方法之一。目前临床使用的XOD抑制剂(如：别嘌呤醇和非布索坦)虽能有效抑制体内XOD活性，降低体内UA含量，但长期服用会出现腹泻、皮疹、头晕等副作用[5]。所以，研发新型、安全的XOD抑制剂势在必行。植物中的多酚和黄酮类化合物具有抑制XOD活性、降低体内UA含量的作用，有研究[6-7]表明，鞣花酸和洋葱总多酚对XOD活性具有较强的抑制作用，其半抑制浓度(IC50)分别为165.6 μmol/L和17.36 μg/mL。因此，从植物中提取多酚、黄酮类等天然成分作为XOD的潜在抑制剂备受业界关注。

刺梨(RosaroxburghiiTratt)是蔷薇科野生药食两用植物，主要分布在我国西南地区，富含黄酮类、维生素C、刺梨多糖等活性成分。研究[8-9]表明，刺梨多酚和黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶均具有明显的抑制作用，且表现出良好的抗氧化活性。但关于刺梨多酚和黄酮类化合物对XOD的抑制作用鲜见报道。基于此，本研究拟以刺梨果实为原料，用体积分数为80%的乙醇提取其活性成分，利用超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-ESI-HRMS/MS)分析刺梨乙醇提取物的主要成分，研究刺梨乙醇提取物对XOD的抑制作用，采用分子对接、分子动力学模拟筛选具有较好XOD抑制活性的成分并阐述其可能的分子作用机制，以期为刺梨的开发利用及天然XOD抑制剂的研发提供理论依据和参考。

1.1 材料与试剂

新鲜刺梨果实，采自贵州省毕节市。XOD(5 U/770 μL)，北京索莱宝科技有限公司产；
黄嘌呤(纯度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司产；
别嘌呤醇(纯度≥98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产；
(-)儿茶素、没食子酸、鞣花酸、槲皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、竹节参皂苷标准品(纯度≥98%)，成都曼斯特生物科技有限公司产。其他常规试剂均为分析纯，天津致远化学试剂有限公司产。

1.2 主要仪器与设备

UHPLC-ESI-HRMS仪，美国赛默飞世尔科技公司产；
ALPHA 1-2 LD plus型冷冻干燥机，德国Christ公司产；
Hei-VAP型旋转蒸发仪，德国Heidolph公司产；
SpecyraMax型酶标仪，美国Sunnyvale公司产。

1.3 实验方法

1.3.1 刺梨乙醇提取物的制备参考孙红艳等[10]的方法，并稍作修改。将新鲜刺梨果实清洗干净后，经冻干、粉碎、过筛获得刺梨粉，于4 ℃保存备用。以1∶5的料液比(mg/mL)在刺梨粉中加入80%(若无特指，文中百分数均指体积分数)的乙醇，于30 ℃、200 W的条件下超声30 min，离心(8000 r/min，15 min)后收集上清液，残渣重复提取2次，合并上清液，旋转蒸发浓缩上清液，冻干后得到刺梨乙醇提取物，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 刺梨乙醇提取物主要成分测定采用UHPLC-ESI-HRMS仪测定刺梨乙醇提取物的主要成分，参考Q.Ma等[11]的方法，并稍作修改。使用Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×2.7 μm)，柱温为室温；
流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱程序为0～2 min，5%B；
2～20 min，5%～50%B；
20～30 min，50%～70% B；
30～32 min，70%B；
32～33 min，5%B；
33～38 min，5%B；
流速为0.5 mL/min；
进样量为2.0 μL。记录负离子模式下的质谱数据。使用全MS扫描，相关参数如下：质谱扫描范围(m/z)为100～1 500 amu，喷雾电压3.3 kV，毛细管温度320 ℃，加热器温度350 ℃，辅助气体流量8.0 L/min，鞘气体流量32.0 L/min，扫描气体流量4.0 L/min。

1.3.3XOD抑制率测定参考A.Mehmood等[12]的方法，并稍作修改。用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH值为7.5)配制质量浓度为1 mg/mL的样品母液，将样品母液稀释至不同质量浓度即得实验待测样品。对照组加入200 μL PBS缓冲液 、100 μL待测样品；
样品处理组加入100 μL PBS缓冲液、100 μL XOD溶液、100 μL待测样品。37 ℃孵育5 min后，各组均加入100 μL黄嘌呤溶液(pH值为8.0)，于37 ℃再孵育30 min后，各组均加入100 μL HCl溶液(1 mol/L)终止反应，于295 nm处测吸光度。两组均设有空白对照，并使用别嘌呤醇作为阳性对照。每个待测样品重复3次实验，待测样品对XOD的抑制率计算公式如下：

式中：A0为PBS缓冲液和黄嘌呤混合后的吸光度；
A1为PBS缓冲液、XOD和黄嘌呤混合后的吸光度；
A2为待测样品、PBS缓冲液、XOD和黄嘌呤混合后的吸光度；
A3为待测样品、PBS缓冲液和黄嘌呤混合后的吸光度。

参考文献[13]计算样品半抑制浓度(IC50)。

1.3.4 分子对接方法从RCSB PDB数据库(https:∥www.rcsb.org/)中获取XOD的晶体结构(PDB:1fiq)，从PubChem数据库 (https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取小分子物质。使用PyMol软件除去XOD中的水和配体[14]，并使用AutoDock Tools1.5.6软件[15]在XOD和配体中添加非极性氢和高斯电荷。在Autodock Vina软件[16]中进行分子对接，使用GetBox plugin (https:∥github.com/MengwuXiao/GetBox-PyMOL-plugin)进行分子对接盒子建立，其中心坐标为：X=25.4 Å，Y=23.7 Å，Z=21.7 Å。根据评分函数计算对接亲和能，筛选出对接亲和能绝对值较高的构象模型，并使用Discovery Studio 2016 Client和PyMol[17]进行分子对接结果的可视化分析。

1.3.5 分子动力学模拟方法使用GROMACS 19.5软件包(https:∥manual.gromacs.org/)进行动力学模拟，在amber FF99SB-ILDN力场中进行分子动力学模拟：1)将体系模拟在TIP3P水模型和0.15 mol/L NaCl溶液中；
2)采用最速下降法进行能量最小化，将能量优化到小于1 000.0 kJ/(mol·nm)；
3)执行正则系综(NVT，2 ns)后，进行等温、等压模拟(NPT，1 ns)，确保在恒定温度和压力(310.15 K，100 000 Pa)下进行下一步操作；
4)对复合物进行100 ns的分子动力学模拟，并使用GPU处理器加速模拟。模拟结束后，使用均方根偏差(RMSD)、蛋白回旋半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA)、氢键数量评估XOD与配体间结合的变化情况。

1.4 数据处理

所有实验均平行3次，结果以(平均值±标准差)表示，使用SPSS 20.0软件进行数据分析和差异显著性分析(P<0.05)，采用Origin 2019b对分析数据作图。

2.1 刺梨乙醇提取物主要成分分析

图1为刺梨乙醇提取物总离子流图，初步鉴定刺梨乙醇提取物中含有18种化合物，这些化合物的主要信息见表1。由表1可知，刺梨乙醇提取物中含有2种有机酸类化合物(抗坏血酸和抗坏血酸衍生物)，10种多酚和黄酮类化合物(没食子酰己糖、原花青素B1、(-)儿茶素，香豆酰葡萄糖、长春花苷、没食子酰儿茶素-(4α->8)-儿茶素、鞣花酸-鼠李糖苷、鞣花酸、槲皮素-3-O-[6″-O-(3-羟基-3-甲基戊二酰)-β-D-半乳糖苷和槲皮素)，6种萜类化合物(刺梨苷1、刺梨苷2、刺梨苷3，1-羟基蔷薇酸、苦楝二醇和美洲茶酸)。刺梨乙醇提取物中物质丰富，其中，刺梨苷2是含量最多的成分，占干物质总质量的19.64%；
(-)儿茶素是含量最多的多酚类化合物，占干物质总质量的8.83%。

2.2 刺梨乙醇提取物对XOD抑制作用分析

不同质量浓度刺梨乙醇提取物对XOD的抑制率如图2所示，其中不同的小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。由图2可知，对XOD的抑制率随刺梨乙醇提取物质量浓度的升高而增加。刺梨乙醇提取物对XOD的IC50为(8.17±0.19)μg/mL，而别嘌呤醇对XOD的IC50为(11.69±0.30)μg/mL。这可能是因为刺梨乙醇提取物中含有多种酚类和黄酮类化合物，使其对XOD的抑制作用强于别嘌呤醇。对比其他研究[21-22]报道，香水莲花花蕊乙醇提取物对XOD的IC50为38.54 μg/mL，桑黄乙醇提取物对XOD的IC50为 0.85 μg/mL，即刺梨乙醇提取物对XOD的抑制作用较好。

图1 刺梨乙醇提取物总离子流图Fig.1 The negative ion current chromatograms of the ethanol extracts from Rosa roxburghii Tratt

2.3 分子对接结果分析

将刺梨乙醇提取物中鉴定出的化合物进行分子对接，结果见表2。由表2可知，槲皮素和(-)儿茶素的对接亲和能绝对值相对较高，其中槲皮素与XOD的对接亲和能为-9.1 kcal/mol，与张静等[21]报道的-9.6 kcal/mol接近，说明本研究的分子对接数据可靠。且有文献[24]报道，槲皮素能通过氢键与大分子物质结合产生相互作用，故选择槲皮素作为阳性对照。图3为(-)儿茶素与XOD相互作用的2D和3D模式图。由图3可知，(-)儿茶素可与大量氨基酸残基(SER876、VAL1011、PRO1076、GLU802、PHE649、LYS771、ASN768、THR803)形成范德华力，与某些氨基酸残基(GLU1261、THR1010、ARG880)形成氢键。其中，PHE649、GLU802等氨基酸残基被证明在黄嘌呤的羟基化中发挥关键作用[25]，(-)儿茶素可能与黄嘌呤竞争结合XOD的活性位点，阻碍黄嘌呤的进入，从而降低XOD活性。鉴于(-)儿茶素在刺梨乙醇提取物中的含量较高，且未见有文献通过分子动力学模拟探究其潜在分子作用机制，故选取(-)儿茶素作为主要活性成分与XOD进行后续分子动力学模拟，研究(-)儿茶素与XOD在模拟过程中的结合稳定性。

表1 刺梨乙醇提取物中的化合物及其定量或半定量信息Table 1 Compounds and their quantitative or semi-quantitative information of the alcohol extracts from Rosa roxburghii Tratt

图2 不同质量浓度刺梨乙醇提取物对XOD的抑制率Fig.2 Inhibition rate of XOD by different mass concentration of alcohol extracts from Rosaroxburghii Tratt

2.4 分子动力学模拟结果分析

分子动力学可用原子尺度动态分析微观相互作用。经一系列动态模拟后，体系通常会达到平衡状态，对平衡后的轨迹进行分析即可根据动力学数据预测物质的宏观性质。RMSD用以衡量特定时间蛋白结构与原始构象的平均偏差，是判断模拟系统是否处于平衡状态的关键指标，可用于查看模拟的收敛性和复合物的稳定性。在整个分子动力学模拟过程中，XOD和XOD-(-)儿茶素复合物RMSD的变化如图4所示。由图4可知，XOD和XOD-(-)儿茶素复合物分别在45 ns和20 ns达到平衡，XOD-(-)儿茶素复合物的RMSD先于XOD达到平衡，其RMSD

表2 分子对接结果Table 2 Results of molecular docking

图3 (-)儿茶素与XOD相互作用2D和3D模式图Fig.3 2D and 3D docking modes of interaction between (-) catechin and XOD

在不同时间段围绕平均值波动并稳定在0.16 nm附近，说明XOD-(-)儿茶素复合物更稳定。100 ns分子动力学模拟中(-)儿茶素结构的变化如图5所示。由图5可知，20 ns和100 ns时的(-)儿茶素在XOD中的构象发生了转动，但相较于0 ns和20 ns时，100 ns时的(-)儿茶素转动幅度较小。

图4 XOD和XOD-(-)儿茶素复合物RMSD的变化Fig.4 RMSD changes of the XOD and XOD-(-) catechin complexes

图5 100 ns分子动力学模拟中(-)儿茶素结构的变化Fig.5 Structural changes of (-)catechin in 100 ns molecular dynamics simulations

图6 XOD-(-)儿茶素复合物氢键数量的变化Fig.6 H-bond number changes of the XOD-(-) catethin complexes

氢键是一种重要的非共价结构力，能够反映(-)儿茶素与XOD结合的稳定性。XOD-(-)儿茶素复合物体系氢键数量的变化如图6所示。由图6可知，在整个100 ns 分子动力学模拟中，(-)儿茶素与XOD间发生了氢键相互作用，且(-)儿茶素与XOD间的氢键数量在2～5个范围内波动；
XOD-(-)儿茶素复合物一直伴随着氢键的断裂和新氢键的形成，导致氢键数量不断变化。在20 ns后依然保持相对稳定的氢键数量(3个)，说明20 ns后，XOD-(-)儿茶素形成了稳定的结构。

Rg通常是评估蛋白质结构变化的表征参数，可描述蛋白质的紧密度，Rg越小则紧密度越好，即蛋白质结构越稳定。XOD和XOD-(-)儿茶素复合物体系Rg的变化如图7所示。由图7可知，XOD-(-)儿茶素复合物的Rg趋势较平稳，稳定在3.1 nm左右，这表明(-)儿茶素与XOD结合后，复合物体系结构紧密。

图7 XOD和XOD-(-)儿茶素复合物Rg的变化Fig.7 Rg changes of the XOD and XOD-(-) catechin complexes

图8 XOD和XOD-(-)儿茶素复合物SASA的变化Fig.8 SASA changes of the XOD and XOD-(-) catechin complexes

SASA用于描述蛋白质的疏水性，氨基酸残基的疏水性可影响蛋白质的折叠。XOD和XOD-(-)儿茶素复合物SASA的变化如图8所示。由图8可知，在40 ns前，XOD 和XOD-(-)儿茶素复合物的SASA波动基本一致，40 ns时，XOD的SASA降低，而XOD-(-)儿茶素复合物的SASA升高，变化趋势与Rg一致，这可能是XOD-(-)儿茶素复合物在模拟过程中形成的氢键数量在此时增加所致。

经过100 ns 分子动力学模拟发现，(-)儿茶素与XOD结合并形成稳定的复合物，相较于XOD，两者的结合导致XOD更加紧密，且影响了(-)儿茶素结合XOD周围的氨基酸残基。通过氢键分析可知，(-)儿茶素与XOD的结合过程一直伴随着氢键的产生和断裂。因此，通过分子对接和分子动力学模拟可知，(-)儿茶素可与XOD长时间稳定结合，并抑制XOD的活性位点。

本文鉴定了刺梨乙醇提取物中的主要成分，研究了刺梨乙醇提取物对XOD的抑制作用，筛选了刺梨乙醇提取物中具有较好XOD抑制活性的成分并探究了其可能的分子作用机制。结果表明，刺梨乙醇提取物中共鉴定出18种化合物，包括2种有机酸化合物、10种多酚和黄酮类化合物、6种萜类化合物，其中刺梨苷2和(-)儿茶素是主要成分，分别占干物质总质量的19.64%和8.83%。刺梨乙醇提取物具有较好的XOD抑制活性，IC50为8.17 μg/mL。(-)儿茶素与XOD的对接亲和能的绝对值较高，其能与XOD多个氨基酸残基通过范德华力、氢键等方式紧密结合，形成构象稳定的复杂体系，从而降低XOD活性。但刺梨乙醇提取物对XOD的抑制活性尚需进一步通过体内实验进行验证，以更好地为开发具有XOD抑制作用的刺梨功能性食品提供理论依据和参考。