高原地区利用法医昆虫学推断死亡时间2例

沈 肖，廖良柱，旦增晋美，常思佳

（1.拉萨铁路公安处, 拉萨 850000；

2.拉萨市公安局刑科所, 拉萨 850000）

拉萨地区位于青藏高原中部，平均海拔3 650 m，拥有“日光城”的美誉，该地氧气稀薄，紫外线强烈，冬季严寒，夏季凉爽，具有青藏高原环境特征的典型代表性，也因此造就了法医昆虫学独特的应用场景。线粒体DNA的COI序列已成熟应用于法医昆虫学种类鉴别[1-4]，其中COI-658bp的种类鉴别效果足以与COI全序列长度相媲美[5]，成为了现今国内外用于尸食性蝇类种类鉴别最为普遍的片段[6-8]。长期以来拉萨乃至青藏高原法医昆虫学的研究还处于起步阶段，缺乏相关的法医昆虫学案例报道[5,9]。本文通过在拉萨地区结合COI-658bp利用昆虫学证据对2例实际案件进行死亡时间推断，探究该地区法医昆虫学的实际应用。

1.1 案例1

2020年7月某日，拉萨市城关区一出租屋内发现一老年男性死者。该出租屋房门反锁，门窗没有发现暴力入侵的痕迹。死者俯卧在室内的水泥地板上，尸体腐败严重，颅面部部分骨骼外露，尸体绝大部分呈木乃伊化，双侧小腿背侧可见细小腐败水泡，尸体周围可见大量黑色腐败液体流出，尸体检验未发现机械性损伤痕迹。在现场发现大量的蝇类成虫及蛹，其中，蛹主要聚集在尸体周围（图1a），挪开尸体，在地板上发现少量的三龄幼虫，现场发现少量的空蛹壳。现场走访发现死者25 d前最后一次出现在邻居视线。从现场采集空蛹壳若干放置于95%乙醇保存并从附近气象站收集相应的气温数据。

1.2 案例2

2020年7月某日，在一出租单元房内发现一男性尸体，门和窗被从里面反锁，勘查人员未发现暴力入侵痕迹；
尸体俯卧在一长椅与办公桌之间的地板上，尸体高度腐败，右手末端骨骼外露，尸体绝大部分呈木乃伊化改变，并流出黑色腐败液体（图1b），尸体检验未发现机械性损伤痕迹。房间内有少量蝇类成虫活动，尸体上发现少量蝇类幼虫及蛹，现场大量蛹分布于房间内墙角及隐蔽处（图1b），现场未发现空蛹壳。通过走访调查，房东15 d前最后一次见过死者。从现场采集蛹若干置于95%乙醇中保存并从现场附近气象站收集气温数据。

图1 现场情况（a：案例1现场尸体及尸体旁昆虫的情况；
b：案例2现场尸体及房间内蛹的分布情况）Fig.1 The scene of two cases (a: corpse and its nearby insects in case 1; b: corpse and scattered pupae in case 2)

2.1 案例1

结合现场走访调查结果，从气象站收集死者被发现之日至25 d前的日平均温度为20.0 ℃。现场收集的空蛹壳（图2a）通过COI-658bp基因测序后得到基因测序结果图（图3a）及碱基序列，将碱基序列导入GenBank进行比对鉴定，经过比对鉴定为新陆原伏蝇Protophormia terraenovae（Robineau-Desvoidy,1830）。根据既有新陆原伏蝇P. terraenovae的等虫态线图数据[10]，在20.0 ℃温度条件下，新陆原伏蝇P.terraenovae从产卵到羽化需要约22 d。因此，综合其他资料，推断死者死亡时间范围为22～25 d之间。

2.2 案例2

从现场附近的气象站收集死者被发现之日至15 d前的日平均温度为19.9℃。现场收集的蛹（图2b）利用COI-658bp经基因测序后得到基因测序结果图（图3b）及碱基序列，同样将碱基序列导入GenBank中进行比对，经比对鉴定为丝光绿蝇Lucilia sericata(Meigen, 1826)。现场收集的蛹经固定并剥开蛹壳后可见隐成虫的头、胸、腹部明显（图2b），根据丝光绿蝇蛹的发育阶段[11]，确定处于Ⅲ期。根据相关资料[10-11]，丝光绿蝇L. sericata在近似的温度（20.0℃）下，从产卵到化蛹需要大约10 d，而其蛹在Ⅲ期阶段生长发育需要2.5～7.5 d。结合现场走访资料，综合推断死者死亡时间范围为12～15 d。

图 2 现场收集的昆虫学证据（a：案例1中的空蛹壳；
b：案例2中的蛹（Ⅲ期））Fig.2 Entomological evidence collected at the scene (a: empty puparias collected in case 1; b: third-stage-living pupae collected in case 2)

图3 COI-658bp基因测序结果图（a：案例1新陆原伏蝇基因测序结果；
b：案例2丝光绿蝇基因测序结果）Fig.3 Result of sequencing COI-658bp gene of (a: Protophormia terraenovae from case 1; b: Lucilia sericata in case 2)

昆虫学证据在腐败尸体的死亡时间推断方面具有独特的实践价值[12-13]，本文两个案例中尸体腐败严重，运用传统尸体死后变化特征难以推断出准确的死亡时间，且现场尸体上均发现尸食性蝇类定殖，具有运用法医昆虫学进行死亡时间推断的基础。目前，DNA分子技术已成熟应用于尸食性蝇类种类鉴别方面，较传统的形态学特征鉴别具有快速、高效、准确的特点，其中COI-658bp能精准进行尸食性蝇类种类鉴别[5,7-8]，且其数据库资料齐全。因此，本文选用COI-658bp作为快速鉴别的片段，以期加快死亡时间推断的速度。经基因鉴定后的尸食性蝇类分别为新陆原伏蝇Protophormia terraenovae和丝光绿蝇Lucilia sericata，它们是拉萨地区夏季的优势种群[5]，相对于该地区其他尸食性蝇类，它们有更多的机会在尸体上侵袭、定殖。

由于蛹的羽化，导致尸食性蝇类成虫出现到空蛹壳样本采集之间的时间无法确定，因而利用尸食性蝇类生长发育周期进行死亡时间推断的准确性较弱[14]，这是目前法医昆虫学应用的一个现实问题。但在案例1中，实际死亡时间与运用法医昆虫学推断的死亡时间较为一致，得益于详细的现场走访调查锁定了最长死亡时间范围。因此，在运用法医昆虫学进行死亡时间推断中结合现场走访调查资料，能有效减少空蛹壳造成的时间上的不确定性。另外利用空蛹壳中的蛋白质、脂质、碳氢化合物进行死亡时间推断也不失为一种有效的方法[15-17]，但是在实际应用前还需要开展更多的研究。

案例2中的实际死亡时间在推断的时间范围内，同样得益于详实的现场调查。我们发现利用丝光绿蝇蛹的发育阶段进行死亡时间推断的范围较为宽泛，甚至超出了实际死亡时间，这无疑降低了利用丝光绿蝇蛹进行死亡时间推断的准确性，原因在于既有资料根据丝光绿蝇蛹的形态学特征划分了8个发育期，其中第Ⅲ期的发育时间最长[11]，因此导致利用蛹形态学进行推断时出现时间范围超过实际死亡时间的情况，如果能将蛹的发育阶段根据形态学特征进行再度细化，划分出更多的发育阶段[18]，那么将进一步提高利用蛹进行死亡时间推断的准确性。尸食性蝇类的差异基因表达或许同样可以有效地解决这一问题[19-20]，但成熟的应用还需要长期的研究。同时，需要注意的是，丝光绿蝇L. sericata与铜绿蝇Lucilia cuprina（Wiedemann,1830）存在天然的种间杂交，DNA分子技术有时无法完全有效区分其杂交种[21]，在条件允许的情况下可以进行蛹培养，采取成虫形态学与DNA分子技术结合鉴定的方法，以提高种类鉴定的准确性。

此次死亡时间推断得出的结果在最长死亡时间范围内，具有较高的实践价值，但也存在不足。其一，虽然通过现场走访确定了最长死亡时间范围，但是案例中死者的具体死亡时间仍无法确定，因而也无法有效检验此次死亡时间推断的精确性。其二，因为精准性得不到有效检验，无法有效验证低海拔地区的尸食性蝇类发育数据在高原地区的实际应用效果。其三，虽然案发地周边的气象站温度数据能为案例提供参考[22-26]，但高原地区受光照影响，室内外温度存在一定差异，如对室内外温度差进行校正，将会进一步提高死亡时间推断的准确性。总的来说，上述两个案例是对前期研究[5]报道的拉萨地区利用三龄幼虫进行死亡时间推断的延伸，利用蛹和空蛹壳来推断死亡时间难度更大，进一步填补了高原地区利用尸食性蝇类的蛹和空蛹壳进行死亡时间推断的空白，同时也暴露出利用蛹、空蛹壳进行死亡时间推断的短板以及亟需解决的问题，这说明还需要长期进行高原地区的法医昆虫学研究来支撑实战的应用。