Sprouty,2在皮肤鳞状细胞癌中低表达并与E-cadherin、Ki-67的表达相关

李超，钟维，朱磊，黄钰淇2,，李锦意，陈永锋

1.深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020；
2.广东医科大学，广东 湛江 524000；
3.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是全球人群中第二常见的皮肤恶性肿瘤，起源于表皮或附属器角质形成细胞。紫外线照射是公认的重要危险因素，其他还包括皮肤慢性溃疡、光化性角化病等癌前病变、基因突变和免疫因素等[1]。CSCC发病机制复杂，目前研究涉及的相关基因通路较多，其中RTK通路作为增殖、分化的主要通路，已被明确作为CSCC的发病机制之一。Sprouty 2是RAS/丝裂原活化蛋白激酶(RAS/MAPK)信号通路中的特异性蛋白，在细胞增殖、迁移、分化和凋亡过程中发挥重要作用[2]。Ki-67是一种特殊增殖细胞核抗原，可间接反映肿瘤细胞的增殖，被广泛用于乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤研究[3]。上皮钙黏着蛋白(E-cadherin, E-cad)是腔上皮细胞中经典跨膜蛋白，通过内吞和胞吐的空间调控作用参与细胞黏附、细胞极性及细胞重排[4]。Sprouty 2在不同肿瘤发生发展中的作用不尽相同，其在皮肤肿瘤中的研究极少[5]，与CSCC是否有关至今未有报道。本研究通过分析CSCC中Sprouty 2的表达及其与E-cad和Ki-67的相关性，为探索Sprouty 2在CSCC发病中的临床意义提供参考。

1.1 研究对象

纳入2018年3—7月在南方医科大学皮肤病医院皮肤科就诊且病理诊断为高分化，即Broders分级Ⅰ级(未分化细胞占全部癌细胞比例<25%)～Ⅱ级(未分化细胞占25%～50%)的头面部CSCC患者[6]。所有患者术前均未行放疗、化疗，未应用免疫抑制剂、冷冻、激光等治疗。排除标准：炎症性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病或其他严重的慢性系统性疾病患者。共纳入15例患者作为病例组，其中男9例，女6例；
年龄50～86(63.13±15.79)岁；
病程3个月～10年。健康对照组10例，全部为南方医科大学皮肤病医院行头面部整形手术的健康人，男女各5例，年龄33～77(57.30±10.07)岁。病例组与对照组的性别(P=0.70)和年龄(t=1.03,P=0.31)比较,差异均无统计学意义。研究方案根据赫尔辛基宣言的原则设计和实施，并经南方医科大学皮肤病医院医学伦理委员会批准(批件号：2017028)，受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人Sprouty 2多克隆抗体(一抗，ab85670，美国Abcam)、抗E-cad抗体(一抗，24E10，美国Cell Signaling)、抗Ki-67抗体(一抗，ARG53222，台湾Arigo)、羊抗兔多克隆IgG抗体(二抗，ARG65351，台湾Arigo)、抗GAPDH抗体(ab181602，美国Abcam)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time )(日本Takara)、SYBR Prime Ex TaqTM Ⅱ(日本Takara)。Nano Drop仪(美国Thermo Fisher Scientific)、 Light Cycler 480 PCR仪(瑞士Roche)、iQ5多色实时PCR检测系统(美国Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 标本取材 所有受试者均在头面部取材，手术切除所需标本，大小约为10 mm×5 mm×3 mm，以癌灶标本作为鳞癌组，以临近癌灶的标本作为癌旁组，以远离癌灶的标本作为病例对照组，以健康人标本作为健康对照组。每组标本分成3份，1份制成蜡块，另外2份装无菌冻存管在液氮内冻存。

1.3.2 免疫组化检测组织标本中Sprouty 2、E-cad和Ki-67的表达 取标本蜡块做4 μm厚度切片待用，脱蜡后置于3% H2O2溶液孵育10 min，随后浸入1×抗原修复液中加热20 min；
分组滴加50 μL抗 Sprouty 2(1 ∶400)、E-cad(1 ∶400)和 Ki-67(1 ∶200)抗体，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次。滴加羊抗兔多克隆抗体(1 ∶500)，37 ℃水浴20 min，PBS冲洗3次；
显色、复染后，于光学显微镜下观察目的蛋白细胞定位及分布情况。用Image Pro软件对阳性染色部位进行测量分析，计算平均光密度(AOD)，AOD=累积光密度/面积。

1.3.3 qRT-PCR检测鳞癌组、癌旁组、病例对照组和健康对照组 Sprouty 2表达 提取组织总RNA：冻存组织称重、研磨，加Trizol试剂裂解、氯仿萃取，离心后取上清并加入异丙醇混匀；
再次离心，取白色沉淀物即组织总RNA；
超纯水溶解后用NanoDrop仪检测RNA浓度，达标后将RNA逆转录成cDNA。

qRT-PCR：以GAPDH为内参照。Sprouty 2正向引物：5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′，反向引物：5′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-3′；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正向引物：5′-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3′，反向引物：5′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-3′。采用20 μL反应体系，在无RNA酶八联管中分别加入10 μL SYBR Prime Ex TaqTM、1 μL cDNA、7 μL超纯水、正反向引物各1 μL。扩增条件95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40个循环。荧光融解得到融解曲线。以2-ΔΔCt表示基因mRNA表达水平。

1.3.4 Western blot检测组织标本中Sprouty 2和E-cad表达 提取冻存组织总蛋白后选择10%二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶，加样后恒压电泳；
转聚偏氟乙烯膜后再次恒流电泳；
取出聚偏氟乙烯膜转至封闭液恒温37 ℃摇床匀速摇60 min；
取膜置于一抗稀释液(Sprouty 2、E-cad抗体工作浓度均为1 ∶1 000，GAPDH抗体为1 ∶10 000)中过夜；
次日加入羊抗兔IgG抗体(1 ∶5 000)孵育60 min，暗房显影。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计学分析。多组间Sprouty 2 mRNA水平等比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Bonferroni法。Sprouty 2与E-cad、Ki-67相关性采用Pearson或Spearman相关分析法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 Sprouty 2 mRNA水平表达

结果显示,4组间Sprouty 2 mRNA表达差异有统计学意义(2=55.00,P<0.01)；
两两比较，鳞癌组Sprouty 2 mRNA表达低于癌旁组(Z=-4.12)、病例对照组(Z=-4.74)和健康对照组(Z=-4.22),差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 各组皮肤组织中Sprouty 2 mRNA和蛋白以及E-cad、Ki-67蛋白的表达水平Table 1 Expression levels of Sprouty 2, E-cad and Ki-67 mRNA and protein in skin tissues of each group

2.2 Western blot检测结果

图1 Western blot检测Sprouty 2和E-cad蛋白在各组皮肤组织中的表达

2.3 免疫组化检测结果

图2 免疫组化检测Sprouty 2、E-cad、Ki-67在鳞癌组、癌旁组、病例对照组及健康对照组皮肤中的表达(200×)

2.4 皮肤鳞状细胞癌中Sprouty 2与E-cad、Ki-67相关性

Spearman相关分析结果显示,Sprouty 2与E-cad呈正相关(r=0.59，P=0.021)；
Pearson相关分析显示,Sprouty 2与Ki-67呈负相关(r=-0.59，P=0.022)。

CSCC是起源于表皮或附属器角质形成细胞的一类恶性肿瘤，其发病机制复杂，病因尚不明确，目前研究涉及的相关基因通路包括TP53通路、NOTCH通路、RAS通路、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路、SRC家族激酶通路、CDKN2A通路、核因子KB通路、转化生长因子β通路和KNSTRN通路等[7]。在无脊椎动物和脊椎动物中受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)通路主要在器官形态形成和发育、细胞增殖和分化等方面发挥作用，过度或不受调控的RTK信号会导致肿瘤形成、病理性新生血管形成和异常发育[8]。该通路由RAS-RAF-MEK-MAPK级联反应和PI3K-AKT通路调节，这两个通路由负反馈环路调节,其中RAS-MAPK信号通路是细胞内增殖、分化中至关重要的信号通路[9]。在动物实验中，RAS原癌基因调控异常参与了小鼠化学致癌模型CSCC的发生[10-11]。此外，日光损伤皮肤(如日光性角化病)中也存在RAS突变，表明RAS突变可能是紫外线损伤引起癌前病变的一个关键环节[12]。通过分子分析、独立验证集和功能研究分析发现，接受BRAF抑制剂治疗的黑素瘤患者发生的CSCC致癌突变中，以HRAS Q61L最常见，而HRAS Q61L突变株增殖与RAS-MAPK通路信号通路和ERK介导的转录激活有关[13]。研究发现，高迁移率盒1蛋白可通过增加p85 PI3K、AKT、p38和P42/44 MAPK的磷酸化水平，显著激活PI3K/AKT和RAS-MAPK信号通路进而调控CSCC转移[14]。由上可知，RTK信号通路活化异常在CSCC的病理生理机制中扮演着重要角色。

Sprouty 2是RAS信号通路特异性抑制蛋白，可抑制成纤维细胞生长因子介导的ERK活化，也可抑制表皮细胞生长因子介导的AKT活化，从而抑制RTK通路，起到抑制细胞增殖、转化和血管生成的作用[2]。Sprouty 2在肾癌、骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤中的表达下调，对肿瘤发生、侵袭、转移发挥重要作用，已被作为判断一些疾病如乳腺癌、肝癌的预后独立因素[15-17]。相反，Dry等[18]发现黑素瘤细胞系的突变体可上调Sprouty 2进而促进恶性黑素瘤发生发展。Liao等[19]发现Sprouty 2在人口腔鳞状细胞癌中过表达。Park等[20]发现Sprouty 2在胶质母细胞瘤表达上调，并增加了肿瘤细胞的致瘤潜能。可见Sprouty 2在不同疾病中参与的角色并不完全相同，可与其他因子相互作用从而抑制肿瘤细胞的增殖、分化，也可因自身基因突变促进肿瘤发生和进展。本研究通过免疫组化、Western blot和qRT-PCR发现,相对于癌旁组、病例对照组和健康对照组，Sprouty 2在CSCC皮损中表达下调，表明Sprouty 2与CSCC存在相关性，提示Sprouty 2可能抑制肿瘤的发生与发展，但其下调的具体机制目前尚不明确，有待进一步研究。

E-cad被认为是上皮癌侵袭和转移的抑制因子。在鳞状细胞癌中，E-cad表达缺失是癌前病变进展到转移浸润的原因之一，并与转移和预后相关[21-22]。So等[23]发现在人高分化浆液性卵巢癌中Sprouty 2与E-cad水平呈正相关，并检测到Sprouty 2位点缺失，过表达Sprouty 2可通过抑制EGF诱导的E-cad下调而抑制卵巢癌细胞侵袭，揭示Sprouty 2在介导EGF对人卵巢癌进展的刺激作用中发挥了重要的肿瘤抑制作用。本研究中E-cad在CSCC皮损中表达下调，与Sprouty 2表达呈正相关，与以上研究结果相符。Brouxhon等[24]研究发现紫外线引起的E-cad丢失与CSCC关系密切，E-cad细胞外结构域片段可与RTK相互作用，通过RTK磷酸化和MAPK/PI3K/AKT/mTOR途径活化促进肿瘤增殖、迁移和侵袭，而Sprouty 2也可通过RTK通路参与肿瘤增殖、分化、迁移等活动，提示在CSCC中Sprouty 2与E-cad可能通过协同作用抑制肿瘤的发生和发展。

Ki-67作为特殊的增殖细胞核抗原可间接反映肿瘤细胞的增殖。CSCC中Ki-67蛋白及mRNA水平均高于正常组织[25]。本研究亦发现，Ki-67在CSCC皮损中表达量上调，与Sprouty 2表达呈负相关，提示Sprouty 2与Ki-67可能通过拮抗作用抑制肿瘤发生和发展。

综上，本研究明确了Sprouty 2与CSCC的相关性，为今后以Sprouty 2作为CSCC生物学行为和治疗有效性的生物学指标研究提供了实验基础和研究方向。但是，Sprouty 2在CSCC发病机制中的作用仍需要深入探索，Sprouty 2是否通过对RTK通路发挥抑制作用参与CSCC发病，有待通过细胞实验和动物实验进一步求证。