麦冬乙醇提取物调控铁死亡抑制肺腺癌A549细胞活性*

范修琦，高稳东，陈玉龙，韩懿存，孟伟，樊李妍，高启龙

1.郑州大学附属肿瘤医院，河南 郑州 450008；

2.河南中医药大学，河南 郑州 450046

肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，2020年全球肺癌发生率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的11.4%和18.0%[1]。随着免疫疗法的发展，肺癌的治疗手段已经非常多样化，但其死亡率仍然很高。因此，探究肺癌的发生机制，寻求新的治疗靶点，对于肺癌的治疗非常重要。铁死亡(ferroptosis)是近年发现的一种铁离子依赖性的非凋亡性细胞死亡形式，主要由细胞中脂质过氧化物(lipid reactive oxygen species，lipid ROS)积累引起[2]。铁死亡作为非凋亡性细胞死亡形式，已逐渐成为清除抵抗凋亡肿瘤细胞的新策略。肿瘤细胞的生长和分裂需要大量能量，而产能过程中伴随着氧化应激和活性氧的积累，此外，肿瘤细胞中存在着应对氧化应激的基因突变，赋予肿瘤细胞生长优势，使其对铁死亡的抵抗力增强[3]。

中医药在癌症的辅助治疗中发挥着重要作用，铁死亡这一新型的死亡方式为中医药抗肿瘤的研究提供了新的靶点。麦冬是一味传统中药，归心、肺、胃经，具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效。多项研究证实，麦冬及其有效成分可通过促进细胞自噬、凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭、迁移等途径发挥抗肿瘤作用[4-5]。此外，麦冬皂苷D(ophiopogonin D，OP-D)能通过调节脂肪酸代谢对抗心肌细胞氧化作用[6]，并能通过干预内质网应激和铁死亡途径降低麦冬皂苷D′的心脏毒性[7]。本课题组前期通过水煎提取、醇浸提取、水提醇沉等多种提取工艺提取麦冬的有效成分，发现麦冬水提物及水提醇沉物对A549细胞没有明显的细胞毒作用，而麦冬乙醇提取物能抑制A549细胞活性，具有明显的细胞毒性。研究发现，麦冬水提及水提醇沉法所得到的多糖成分居多[8]，而经醇提所得的化合物则以皂苷类为主[9]。麦冬乙醇提取物能抑制A549细胞活性，但具体分子机制并不明确，对于其是否能调控细胞铁死亡尚未有研究。本文将通过考察麦冬乙醇提取物对A549细胞的毒性作用，研究其抑制A549细胞活性与铁死亡的关系，进一步探讨麦冬乙醇提取物抗肿瘤的分子机制。

1.1 细胞人肺腺癌A549细胞株由河南中医药大学方证信号转导实验室馈赠。

1.2 药物与试剂麦冬[中国北京同仁堂(集团)有限公司，批号：20101004]。无水乙醇(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：21061223)；
DMEM高糖培养基、PBS缓冲液(pH7.2～7.4)、胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量检测试剂盒、ECL Plus超敏发光液(北京索莱宝科技有限公司，货号：12100、P1020、T1320、M1020、D8370、BC1175、PE0010)；
胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，上海双洳生物科技有限公司，货号：S711-001S)；
BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0146)，蛋白Marker(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：26616)；
Anti-Keap1抗体、Anti-Nrf2抗体、Anti-NOX1抗体、Anti-COX2抗体、Anti-FHC、Anti-FACL4抗体(英国abcam公司，货号：ab139729、ab62352、ab131088、ab179800、ab75972、ab155282)；
GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗兔 IgG抗体(美国CST公司，货号：2118S、7074S)；
ReverTra Ace qPCR RT Kit[东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：FSQ-101]；
2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix(武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：RM21203)。

1.3 仪器超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，型号：37997)；
CO2培养箱(德国Eppendorf 公司，型号：170R)；
倒置显微镜(德国LEICA公司，型号：DFC450C)；
电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司，型号：XB120A)；
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52AA)；
真空泵(河南巩义市英峪华中仪器厂，型号：SHZ-D)；
冷冻干燥机(北京四环起航科技有限公司，型号：LGJ-12A)；
流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCalibur)；
酶标仪(美国BIO-TEK公司，型号：ELx-800)；
凝胶成像扫描仪(美国BIO-RAD公司，型号：ChemiDoc XRS+)；
实时荧光定量 PCR 仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：QuantStudio 6)。

2.1 药物制备称量麦冬50 g并粉碎，按质量体积比1：10的比例加入70%乙醇500 mL，避光冷浸1周，每天搅拌1次，1周后过滤，3 000 r·min-1离心10 min，收集上清，旋转蒸发，回收乙醇，浓缩并干燥成膏状，称量收集药物的质量，计算出膏率。出膏率=提取物质量/生药质量×100%=0.090 8 g/50 g=0.181 6%。使用时先用DMSO配置药物母液250 g·L-1，再用培养基配置成浓度为50 g·L-1的中间工作液，给药时用培养基分别配置成浓度为400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的溶液。

2.2 细胞培养10% FBS与90% DMEM高糖培养基混匀，配制成完全培养基，在37 ℃、5%CO2浓度及饱和湿度下培养A549细胞，每3～4 d传代一次，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2.3 MTT检测麦冬乙醇提取物对A549细胞活性的影响调整A549细胞密度至4.0×104mL-1，接种于96孔板中，每孔200 μL，培养24 h后，分别加入浓度为400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的含药培养基，对照组加入完全培养基，每组设5个复孔，周围用PBS封边，设为空白孔；
培养 48 h 后，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g·L-1)的DMEM培养基，培养4 h后每孔加入150 μL DMSO，震荡混匀，孔内甲臜结晶完全溶解后，测定570 nm波长处光吸收值。

细胞活性=(OD给药孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100%

2.4 流式细胞术检测A549细胞凋亡调整A549细胞密度至1.5×105mL-1，接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h后分别加入浓度200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含药培养基，培养48 h后，收集培养基上清，用不含EDTA的胰酶消化细胞并收集，PBS清洗并收集孔内残留细胞，做好标记，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，PBS清洗两遍后加入稀释好的1×Buffer，于避光处每管加入 10 μL Annexin V和5 μL PI染色液染色，轻微震荡混匀后，避光孵育10 min，上机检测。

2.5 A549细胞中GSH含量变化检测调整A549细胞密度至1.25×105mL-1，接种于培养皿中，每皿8 mL，培养24 h后分别加入浓度为200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含药培养基，培养48 h后，用胰酶消化细胞并收集，600×g离心10 min，弃上清，用PBS清洗两遍后，加入3倍细胞沉淀体积的试剂重悬细胞，于液氮中速冻，并用37 ℃水浴溶解，反复冻融3次后，8 000×g离心10 min，收集上清。按照试剂盒说明书操作配置标准曲线并测量GSH的含量，实验重复3次。

2.6 Western Blot检测A549细胞FHC、COX2、FACL4、Keap1、Nrf2蛋白表达水平调整A549细胞密度至1.25×105mL-1，接种于培养皿中，每皿 8 mL，培养24 h后分别加入浓度为200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含药培养基，培养48 h后，BSA提取细胞总蛋白后采用BCA法检测蛋白浓度，然后进行蛋白变性，配胶，电泳，转膜，封闭，一抗采用5%脱脂牛奶稀释(GAPDH、Keap1、Nrf2、FHC按照1：1 000的比例稀释，COX2稀释比例为1：2 000，FACL4稀释比例为1：20 000)，孵育2 h，二抗采用5%脱脂牛奶稀释(稀释比例为1：1 000)，孵育1 h，ECL超敏发光液显色。用BIO-RAD全能型凝胶成像分析系统显影，目的蛋白相对表达量=目的蛋白表达量/内参表达量，分析目标条带的光密度值。实验重复3次。

2.7 RT-PCR法检测A549细胞FHC、COX2、FACL4、Keap1及Nrf2的mRNA表达水平调整A549细胞密度至1.5×105mL-1，接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h后分别加入浓度为 200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含药培养基，培养48 h后，使用Trizol试剂提取总RNA，检测RNA浓度，将RNA在65 ℃条件下进行5 min的预变性，再按照如下反应体系(表1)，在37 ℃条件下进行 15 min 的逆转录反应，在98 ℃条件下进行 5 min 的酶失活反应，将RNA逆转录为cDNA后冰上配置如下PCR反应体系，添加完毕后小心震荡混匀并瞬时离心，将配好的反应体系(表1)转移至PCR板内，光学密封薄膜密封，PCR板2 500 r·min-1离心 60 s，上机进行RT-PCR反应，扩增条件：95 ℃预变性3 min，1个循环，循环反应95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s，40个循环。数据采用2-ΔΔCt方法进行相对定量分析，考察相关基因mRNA表达水平。引物由河南点睛生物科技有限公司合成，引物序列见表2。

表1 逆转录体系及PCR扩增体系

表2 引物序列

3.1 麦冬乙醇提取物对A549细胞活性的影响采用MTT法检测麦冬乙醇提取物对A549细胞活性的影响，结果显示：麦冬乙醇提取物能明显抑制A549细胞活性，且抑制作用与浓度成正比。利用SPSS 25.0统计软件计算出麦冬乙醇提取物对A549细胞的IC30为93.660 mg·L-1，IC50为208.853 mg·L-1。为方便计算，分别选取100 mg·L-1和200 mg·L-1代表IC30和IC50进行后续试验。见图1。

图1 麦冬乙醇提取物对A549细胞活性的影响(n=5)

3.2 麦冬乙醇提取物对A549细胞形态变化的影响显微镜下观察显示，0 mg·L-1组A549细胞呈梭形；
麦冬乙醇提取物作用后，A549细胞数量明显减少，且 200 mg·L-1组A549细胞体积明显缩小，胞质固缩。见图2。

注：A：0 mg·L-1组；
B：100 mg·L-1组；
C：200 mg·L-1组图2 A549细胞形态改变(×200)

3.3 麦冬乙醇提取物对A549细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测麦冬乙醇提取物对A549细胞凋亡的影响，结果显示：与0 mg·L-1组相比，麦冬乙醇提取物能显著提高A549细胞凋亡水平(P<0.01)，且200 mg·L-1组细胞凋亡率显著高于 100 mg·L-1组(P<0.001)。见图3及图4A。

注：A：0 mg·L-1组流式图；
B：100 mg·L-1组流式图；
C：200 mg·L-1流式图图3 麦冬乙醇提取物对A549细胞凋亡的影响(n=5)

3.4 麦冬乙醇提取物对A549细胞GSH水平的影响GSH是细胞内重要的抗氧化剂，与铁死亡呈负相关。结果显示，与0 mg·L-1组相比，麦冬乙醇提取物能显著降低GSH水平(P<0.01)。见图4B。

注：0 mg·L-1组比较，**P<0.01；
A：麦冬乙醇提取物诱导A549细胞凋亡；
B：A549细胞中GSH含量变化图4 麦冬乙醇提取物对A549细胞的影响(n=5)

3.5 麦冬乙醇提取物对A549细胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表达的影响为了探究麦冬乙醇提取物对A549细胞的抑制作用与铁死亡的关系，检测了铁死亡相关因子FHC、COX2、FACL4蛋白和基因的表达。结果显示：与0 mg·L-1组相比，麦冬乙醇提取物能显著上调FHC蛋白和mRNA及COX2mRNA的表达水平(P<0.05)。见图5。

注：A：FACL4、COX2、FHC mRNA表达水平比较；
B：FACL4、COX2、FHC蛋白表达水平比较；
C：FACL4、COX2、FHC蛋白条带图；
与0 mg·L-1组比较，*P<0.05，**P<0.01图5 麦冬乙醇提取物对A549细胞FACL4、COX2、FHC蛋白和基因表达的影响(n=3)

3.6 麦冬乙醇提取物对A549细胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表达的影响与0 mg·L-1组相比，麦冬乙醇提取物能显著降低Keap1和Nrf2蛋白及基因的表达水平(P<0.05)。见图6。

注：A：Keap1、Nrf2 mRNA表达水平比较；
B：Keap1、Nrf2蛋白表达水平比较；
C：Keap1、Nrf2蛋白条带图片；
与0 mg·L-1组比较，*P<0.05，**P<0.01图6 麦冬乙醇提取物对A549细胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表达的影响(n=3)

肺癌恶性程度高，治疗效果有限，预后较差，因此寻找新的治疗肺癌的途径至关重要。铁死亡是一种有别于凋亡、坏死、自噬等方式的新型细胞程序性死亡，细胞中游离铁经Fenton反应产生活性氧自由基，或通过参与酶促反应诱导膜脂多不饱和脂肪酸氧化[10]。同时，细胞中存在清除脂质过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 4，GPX4)、辅酶Q氧化还原酶(CoQ oxidoreductase，FSP1)等抵抗脂质过氧化损伤的保护性机制，使细胞内ROS处于动态平衡状态。而当细胞中ROS积累过多，GPX4等保护性通路失活时，细胞膜的通透性和稳定性被ROS破坏，最终诱发铁死亡[11]。肺癌组织普遍有着更高的活性氧和脂质氧化标志物水平，肺癌组织中普遍高表达铁蛋白，并使血清铁蛋白水平升高[12]，此外，铁死亡诱导能够增强放疗及化疗的敏感性[13-16]，也进一步说明铁死亡与肺癌关系密切。

麦冬具有滋阴润肺、养阴生津的功效，以麦冬为主药的抗癌方剂如沙参麦冬汤、麦门冬汤等在肺癌的临床治疗中发挥着重要作用，能提高患者免疫水平，提高放化疗的敏感性，降低放化疗的副作用[17-19]。麦冬也是一味抗癌中药，通过多种途径发挥抗癌作用，麦冬中的皂苷D、黄酮类化合物可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活，导致A549细胞自噬[20-21]。

GSH是细胞内重要的抗氧化剂，是GPX4重要的合成底物，GPX4通过减少铁依赖的脂质过氧化物转变为高活性的脂质自由基，减少ROS的积累而抑制铁死亡[22]。GSH与铁死亡呈负相关，常用来衡量铁死亡的水平。本研究中，麦冬乙醇提取物显著抑制GSH的水平，提示麦冬乙醇提取物可能促进A549细胞铁死亡。

为了探究麦冬乙醇提取物对A549细胞活性的抑制作用与铁死亡的相关性，本文检测了铁死亡相关因子COX2、FACL4、FTH1的表达。COX2是一种铁死亡敏感蛋白，在铁死亡发生时被显著上调。本研究发现，在麦冬乙醇提取物作用下，COX2表达增多。FACL4是脂肪酸代谢的第一步，在体内催化合成脂酰CoA，将长链多不饱和脂肪酸活化，以参加膜磷脂的合成，但是这些膜上的长链不饱和脂肪酸常被氧化，从而诱发铁死亡[23]。FACL4表达与细胞铁死亡敏感性正相关[24]，可通过增加多不饱和脂肪酸比例，降低脂质氧化耐受性，易化铁死亡[25]。在本研究中，麦冬乙醇提取物作用下，FACL4表达增多。铁蛋白是位于细胞质、细胞核和线粒体中的主要细胞内储铁蛋白，在铁代谢中起主要作用[26]。铁蛋白是一种24个亚基的球形和空心蛋白质复合物，细胞质铁蛋白由两种不同类型的亚基组成：19 kDa碱性 FLC 亚基和21 kDa酸性FHC亚基。FHC具有亚铁氧化酶活性，可特异性地将二价铁 (Fe2+)氧化为三价铁 (Fe3+)[27-28]。发生铁死亡的细胞中，铁蛋白重链FHC表达升高[29]。在本研究中，麦冬乙醇提取物能够促进A549细胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表达，促进A549细胞铁死亡。

不仅是铁死亡，脂质过氧化在细胞凋亡中同样起着重要作用。脂质过氧化产物与膜受体和转录因子相互作用可以刺激内在和外在的凋亡信号通路，从而诱导细胞凋亡[30]。细胞内GSH浓度降低是线粒体凋亡信号传导、氧化应激等诱导的凋亡级联反应的早期事件[31]，GSH耗竭是由包括细胞毒性药物刺激、压力及环境因素等引发的凋亡性细胞死亡的共同特征[32]。本研究中，麦冬乙醇提取物能明显增加A549细胞的凋亡程度，可能与抑制GSH相关。

此外，为了研究麦冬乙醇提取物促进A549细胞铁死亡的具体机制，本研究检测了Keap1、Nrf2分子的表达。Nrf2主要调节细胞抗氧化反应、氧化还原稳态和代谢平衡，是重要的氧化还原敏感性转录因子，Nrf2泛素化后易位至细胞核，通过与sMAF蛋白的异二聚化作用结合到靶基因的ARE/EpRE(抗氧化反应元件/亲电响应元件)，诱导一系列细胞保护性基因表达，如NQO1、GST、HMOX1、GCL、GSH，抑制细胞铁摄取、限制 ROS 产生，是铁死亡的重要抑制剂[33]。Keap1是Nrf2上游的重要的负调节因子[34]，有研究证实，P62能够通过Keap1促进Nrf2的激活，从而抑制肝癌细胞 HCC铁死亡[35]。在本研究中可以观察到，麦冬乙醇提取物能显著抑制A549细胞活性，抑制强度与药物浓度成正比，同时，麦冬乙醇提取物能显著提高A549细胞凋亡水平。进一步研究发现，麦冬乙醇提取物能够在基因和蛋白水平抑制A549细胞Keap1、Nrf2的表达，两者作为铁死亡的通路抑制分子，能抑制铁死亡，提示麦冬乙醇提取物促进细胞铁死亡作用可能与Keap1/Nrf2通路相关。

综上所述，麦冬乙醇提取物可通过抑制A549细胞GSH水平，促进A549细胞铁死亡相关分子的表达，促进细胞凋亡，从而抑制A549细胞活性，其作用机制可能与抑制Keap1/Nrf2途径有关。后期我们将运用铁死亡抑制剂及Nrf2抑制剂进一步实验，以求它们之间的相关性；
同时在体内进行验证对比麦冬乙醇提取物的疗效；
最后，将通过药物质谱分析进一步筛选麦冬乙醇提取物中发挥主要作用的有效成分并进行验证，为肺癌的中医药治疗提供了新的靶点和理论依据，为其临床应用提供理论支持。