HLA新等位基因B*46：30序列分析及其编码MHC蛋白分子结构预测,与表型鉴定①

聂向民 朱传福 朱海峰 张 毅 乔文本 刘 艳 邵静茹

（山东省血液中心中华骨髓库山东省分型实验室/HLA研究室，济南 250014）

人 类 白 细 胞 抗 原（human leukocyte antigen， HLA）是人类最复杂、最具多态性的免疫遗传系统，在自我识别和免疫应答中发挥重要作用。HLA等位基因的发现鉴定对于阐明人类免疫系统的基因多样性十分重要。截至2021年9月，已发现报道HLA等位基因30 862个［1］。随着分子生物学技术与测序分型技术的发展，越来越多的HLA新等位基因被发现报道。一般仅对HLA新等位基因序列进行一般性描述，未对其编码氨基酸差异在MHC分子结构中的可能影响进行分析，对其血清学表型一般也较少检测鉴定。本实验室在对山东地区中华骨髓库造血干细胞供者进行HLA高分辨分型时，发现1例HLA-B位点新等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会命名为B*46：30。通过SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB软件，对其氨基酸变异在MHC编码蛋白分子三维结构中的可能影响进行模拟分析，应用Histocheck、FATCAT软件在线对比分析其蛋白分子间差异，并对其血清型表型进行检测鉴定，现报告如下。

1.1 资料 样本来自中华骨髓库，造血干细胞志愿捐献者为山东淄博地区的汉族男性。

1.2 方法

1.2.1 Luminex液相流式PCR-SSOP分型 HLAA、B、DRB1高分辨分型采用Luminex平台液相流式PCR-SSOP杂交分型，使用美国One Lambda LABType®HD分型试剂。首先进行HLA位点PCR扩增，然后对DNA扩增产物进行变性、中和，磁珠探针杂交，洗涤，SAPE（Streptavidin phycoerythrin）荧光标记，洗涤，上机检测读取数据。

1.2.2 PCR-SBT分型 PCR-SBT（Sequence based typing）复核使用ROSE Europe HLA SBT分型试剂。进行HLA位点PCR扩增，产物经ExoI/SAP酶纯化后，对HLA-A/B位点2、3、4外显子进行正反双向测序PCR，测序产物经乙醇/醋酸钠沉淀，热变性速冷后ABI 3730毛细管测序电泳。Conexio分析软件判读分型结果。

1.2.3 单等位基因特异性测序 使用HLAssure SE SBT（Texas BioGene Inc.， Texas， USA.）单等位基因组特异性测序分型试剂，首先对样本HLA-B*46、B*57进行等位基因组特异性扩增，以分开该位点的杂合等位基因。扩增产物ExoI/SAP酶纯化后，以阳性组PCR产物为模板，进行2、3、4外显子正反双向测序PCR，1、5外显子正向测序PCR。测序PCR产物再经回收纯化、热变性速冷， ABI 3730测序仪测序电泳分析。AceuType SBT分型软件数据分析。

1.2.4 MHC蛋白分子三维结构预测与差异分析

1.2.4.1 模拟分析差异氨基酸残基在MHC蛋白分子三维结构中的空间位置、理化性质等变化 将新等位基因B*46：30及提交SWISS-MODEL同源建模在线服务器，结果数据文件通过RCSB PDB软件，获得MHC分子三维结构模拟图像。HLA-B46蛋白分子结构由RCSB PDB数据库获得。模拟分析差异氨基酸残基在MHC蛋白分子三维结构中的空间位置、理化性质等变化差异。

1.2.4.2 DSS值比较 HISTOCHECK在线比较B*46：01与B*46：30间差异，并将B*46：01与B*46：30及B*46常见及确认等位基因（common alleles and well documented alleles，CDW）：B*46：08、B*46：09、B*46：12、B*46：18、B*46：19间DSS值（dissimilarity score），以及A*02：01与A*02：03间DSS值进行比较［2-3］。

1.2.4.3 RMSD值比较 FATCAT在线比较B*46：30与B*46：01间均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD），并将B*46：01与B*46：30及B*46 CDW常见及确认等位基因间RMSD值，以及A*02：01与A*02：03间RMSD值进行比较［4］。

1.2.5 血清学表型检测鉴定 血清学表型检测使用Terasaki HLA Class I Asian Dry Typing Tray，Lot#2 Cat. ASN72D分型板进行微量淋巴细胞毒试验。重新采集捐献者新鲜ACD抗凝静脉血，One Lambda荧光磁珠法分离T淋巴细胞，RPMI1640培养液混悬调整细胞数为2 000个/μl，分型板每孔中加入淋巴细胞1 μl，OLI补体1 μl，37 ℃孵育1 h，加入荧光终止剂5 μl。Olympus荧光倒置显微镜观察结果。NIH法分数判定：1%～10%死细胞为1分（阴性）；
11%～20%死细胞为2分（阴性可疑）；
21%～40%死细胞为4分（弱阳性反应）；
41%～80%死细胞为6分（阳性反应）；
81%～100%死细胞为8分（强阳性反应）。

2.1 Luminex PCR-SSOP分型 HLA Luminex流式SSOP杂交分型显示B位点结果异常，无法给出完全匹配的分型结果。

2.2 PCR-SBT分型 HLA-B位点SBT双链混合测序复核，显示该位点无法给出完全匹配的分型结果。结果显示该位点同源性最高的等位基因组合为B*46：01：01、57：01：01，但存在2个碱基差异，即第3外显子第559位核苷酸序列为S（C/G）而非C，第560位为W（A/T）而非T（图1），存在2个碱基差异替代。

图1 PCR-SBT结果Fig.1 PCR-SBT results

2.3 单等位基因组特异性测序 单等位基因组特异性测序表明初次SBT结果所显示碱基改变发生在B*46：01：01序列，即第3外显子第559、560位核苷酸发生C-＞G、T-＞A替代改变（图2），其相应第163位密码子由CTG＞GAG，其编码氨基酸由亮氨酸（Leu，L）变为谷氨酸（Glu，E）。

图2 单等位基因SBT测序结果Fig.2 Single allele specific SBT results

2.4 申报命名 将序列递交NCBI GenBank数据库，注册序列号JN209964，经EMBL-EBI申报被世界卫生组织WHO HLA因子命名委员会正式命名为B*46：30。其HLA-A、B、DRB1位点最终分型结果为A*02：07，24：02；
B*46：30，57：01：01；
DRB1*07：01， 08：03。

2.5 新等位基因编码蛋白分子三维结构模拟分析

2.5.1 蛋白分子三维结构 使用SWISS-MODEL同源建模及RCSB PDB软件，获得B*46：30编码蛋白分子三维空间结构模拟图像见图3。HLA-B46蛋白分子结构（X-ray Diffraction 1.6 Å）由RCSB PDB数据库获得。

图3 B*46：01与B*46：30编码MHC蛋白分子三维结构预测Fig.3 Comparisons of predicted MHC molecular structures between B*46：01 and B*46：30 molecules

模拟分析显示，B*46：30第163位差异氨基酸残基位于α2结构域构成抗原结合凹槽groove侧壁的α螺旋上。相较于B*46：01，HLA-B*46：30第163位氨基酸残基由疏水性脂肪族亮氨酸（L）→B*46：30带负电荷的酸性谷氨酸（E）。RCSB PDB模拟分析还显示，B*46：30的该谷氨酸残基（163E）侧链上的羧基COOH可跨越groove凹槽与α1结构域α螺旋上第62位碱性精氨酸（62R）侧链上的C=NH之间形成氢键。

2.5.2 Histocheck在线比较B*46：01与B*46：30差异 R值（Risler"s score）及DSS（Dissimilarity score）值，见表1。B*46：01与B*46：30、B*46CDW（常见及确认等位基因）间DSS值［3］，以及A*02：01与A*02：03 间DSS值比较，见表2。

表1 B*46：01与B*46：30 间结构比较DSS值及R值Tab.1 DSS Score and R Score compared between B*46：01 and B*46：30

表2 B*46：01与B*46：30、B*46 CWD间， A*02：01与A*02：03间DSS值Tab.2 DSS of structure comparisons between B*46：01 and B*46：30/B*46CWD，A*02：01 and A*02：03

2.5.3 FATCAT在线比较B*46：01与B*46：30、B*46 CDW间差异，以及A*02：01与A*02：03间差异 RMSD（root-mean-square deviation）值（Å）比 较见表3。

表3 B*46：01与B*46：30、B*46 CWD间，A*02：01与A*02：03间结构比较RMSD值（Å）Tab.3 RMSD（Å） of structure comparisons between B*46：01 and B*46：30/B*46CWD， A*02：01 and A*02：03

2.6 血清学表型检测鉴定 HLA-B位点血清学表型检测鉴定反应格局，见表4。其中12D、12E、6E、12A孔反应结果见图4、图5。血清学检测结果显示B46特异性（12D、12E孔）呈强阳性反应。

图4 Terasaki HLA Ⅰ类分型板表型鉴定12D、12E孔反应结果Fig.4 Reactions of 12D， 12E of Terasaki HLA class Ⅰasian typing tray

图5 Terasaki HLA Ⅰ类分型板表型鉴定6E、12A孔反应结果Fig.5 Reactions of 6E，12A of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

表4 Terasaki HLA Ⅰ类分型板表型鉴定反应格局表Tab.4 Reaction results（ Worksheet） of Terasaki HLA class Ⅰ asian typing tray

HLA编码基因位于人类第6号染色体短臂6P21.31～21.33，由一组紧密连锁的复等位基因位点组成，是人类基因组中已知基因最密集的区域。其基因结构以高度多态性为主要特征，每个位点含有大量的复等位基因，且其分布具有明显的种族、地区差异。HLA的这种高度多态性显示了遗传背景的多态性和复杂性，被认为是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现，使人类具有更大的抵抗病原体入侵的能力，对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。

B*46等位基因在亚洲人群中频率较高，明显高于高加索白人和黑人。B*46：01在亚洲、高加索白人、黑人人群中基因频率分别为7.46%、0.06%、0.05%［5］。B*46：01在 中 国 人 群 中 基 因 频 率 为10.42%［3］。如按4位高分等位基因计算，B*46：01频率高于B*40：01（9.787%）而在B位点中位列首位［3］。在本实验室所作低分辨分型基因频率统计中，B*46在山东地区（中国北方）人群中频率（0.0558），位列B*13（0.1431）、B*15（62）（0.0727）、B*51（0.0702）、B*15（60）（0.0605）之后［6］。

为了对B*46：30差异氨基酸残基在MHC分子三维结构中的空间位置及其可能的生物学影响进行模拟分析，使用SWISS-MODEL在线服务器及RCSB PDB软件，对其MHC编码蛋白分子结构进行模拟分析，以期对其编码氨基酸残基改变对MHC分子抗原多肽结合及TCR/抗体结合功能的可能影响进行初步预测分析。

既往研究显示，构成抗原多肽结合凹槽的氨基酸残基，对其抗原多肽结合特性至关重要，以上关键位置单个氨基酸残基理化性质的改变，包括残基侧链的大小、伸展方向、疏水性等理化性质的改变，都可对结合凹槽与抗原多肽的结合产生影响，并可直接或通过与多肽结合特异性的改变，影响HLA等位基因与T细胞受体（T cell receptor，TCR）及抗体的结合。此外，α螺旋上表面朝向上外侧残基侧链理化性质的改变，以及引起的可与TCR/抗体结合区域表面结构形状的改变，都可引起与TCR和/或抗体结合功能的改变［7-8］。同时这些区域也是序列多态性集中的区域。

通过模拟分析可得，B*46：30的第163位差异氨基酸残基位于抗原结合凹槽侧壁的α螺旋上的关键位置。相较HLA-B*46：01，B*46：30第163位氨基酸残基由疏水性脂肪族亮氨酸L变为带负电荷的酸性谷氨酸E。PDB模拟分析还显示，发生改变以后，该163位带负电荷的酸性谷氨酸（163E）侧链上的羧基COOH可跨越groove凹槽与α1结构域α螺旋上的第62位碱性精氨酸（62R）侧链上的C=NH之间形成氢键。HistoCheck分析示其R值=32，并显示163位为9肽P1、P2、P3位、HLA I类多肽以及TCR的结合位点［9］。以往研究显示该位置是参与构成抗原多肽结合凹袋Pocket A的关键位置［10］。同时，该位置亦是B*46：01构成163LW eplet的关键位置，也是许多HLA-I类等位基因构成163 eplet的关键位置［11］。根据结果推测，以上改变将有可能对其groove结合凹槽的多肽结合特性，以及α螺旋与TCR和/或抗体的结合特性产生影响，引起其结合特性的改变。

R值是由RISLER等［12］提出的通过氨基酸距离矩阵计算单对氨基酸交换之间的差异。其基本概念是，如果两种氨基酸越相似，则它们在功能相关蛋白中相互替换的频率越高。因此具有低取代率的氨基酸对（代表功能差异）产生更高的分值。DSS值是将HLA分子的多态性残基分为主要（肽结合凹槽和/或TCR接触区域）和次要（剩余氨基酸残基）潜在同种异体反应性区域，通过将不同区域中每对氨基酸差异的R值加权相加而得出DSS值，作为一种同种反应性指标［13］。

通过将B*46：30及B*46常见及确认等位基因与B*46：01间的DSS值比较可以看出，B*46：30与B*46：01的DSS值1.32处于较低水平，明显低于A*02：01与A*02：03间的3.98。A*02：03与A*02：01是临床低分辨分型需要分开的不同血清型的等位基因，具有较高的同种反应差异性。这可能与B*46：30与B*46：01间仅存在单个氨基酸差异有关。但通过FATCAT在线分析，获得B*46：01与B*46：30间RMSD值为0.59 Å，可以看到B*46：01与B*46：30间RMSD值较高，甚至高于A*02：01与A*02：03间的0.44 Å，与DSS值之间并无较一致的对应关系。这也反映了现有众多自动蛋白质结构对比算法常产生难以解释的矛盾结果，且难以确定界值的现实状况［14-15］。有国内研究将修正RMSD值定为0.50Å，作为allo-HSCT异基因造血干细胞移植发生Ⅰ/Ⅱ级aGVHD与Ⅲ/Ⅳ级aGVHD间的分界值［16］。

B*46：30血清学表型检测显示其B46特异性呈强阳性反应，即其表型鉴定为B46，显示该血清学抗原分型板中所含单克隆抗体微量淋巴毒反应未能对B*46：30的163LW→EW eplet改变产生可见差异反应。另外，本次检测6E孔（B7+/-55）显示存在部分死细胞的弱阳性反应，分析怀疑该交叉反应是否可能由B7的163EW的eplet引起，有待进一步验证。此外，12A孔BW6反应阴性，考虑可能为抗体血清学反应质量问题。

虽然B*46：30血清学表型鉴定为B46未见明显改变，但通过以上分析，本课题组推测其差异氨基酸残基的改变，在可能导致B*46：30多肽结合功能的改变的同时，仍有可能直接及/或通过多肽结合功能的改变，影响其与TCR及抗体的结合特性，并可能对临床造血干细胞移植及排异反应产生影响。上述推测尚需今后进一步研究证实。

在国内已发现HLA新等位基因的报道中，一般仅对其变异序列进行一般性描述报告，未对其结构差异及生物学影响进行探讨分析。本文通过对B*46：30编码蛋白分子三维结构模拟分析，对其差异氨基酸变异的可能影响进行初步探讨分析，对今后新等位基因功能研究具有一定的借鉴意义。