穿心莲内酯介导IL-23/Th17对重症肺炎大鼠的作用

沈洪丽， 张良东，郭连胜， 沈红瑞， 张 梅

1.沧州市中心医院重症医学科，沧州 061000；
2.沧州市中心医院感染内二科，沧州 061000；
3.沧州市传染病医院检验科，沧州 061000；
4.沧州市人民医院急诊科，沧州 061000；
5.沧州市传染病医院肝病六科，沧州 061000

肺炎是肺泡、肺间质、中末气道炎症的统称，重症肺炎为其严重阶段，致死率较高。肺炎的致病因素较多，以细菌感染为主，肺炎克雷伯菌肺炎是典型的细菌性肺炎。据报道[1]，炎性细胞因子释放诱发的炎性反应为肺炎主要病理损伤机制，故抗炎为治疗肺炎克雷伯菌所致重症肺炎的第一要务。穿心莲内酯对细菌感染性肺炎有特殊功效[2]。重症肺炎发生、发展与免疫功能下降密切相关，林克武等[3]研究表明穿心莲内酯还有增强免疫功能的作用。ZELANTE T等[4]报道，在真菌感染的实验模型中，对免疫抵抗的正面和负面影响都归因于IL-23/Th17轴。故本研究拟建立肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠模型，分析穿心莲内酯对大鼠IL-23/Th17平衡的影响及其对肺部损伤的作用与机制。

1.1 仪器

CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1.2 试药

穿心莲内酯粉末(广西昌洲天然药业有限公司，质量分数98%)；
地塞米松片(广东华南药业集团有限公司，国药准字H44024469，规格0.75 mg)；
肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)由广州市第一人民医院检验科细菌室提供；
FITC-CD4、FITC-IL-17单克隆抗体，均购自法国IMMUNOTECH S.A.S公司；
兔抗大鼠核转录因子kappaB(NF-κB)、p-NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和p-IκBα、GAPDH一抗，均购自英国Abcam公司；
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(海古朵生物科技有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，60只，7周龄，体质量260～270 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK(京)2019-0010，饲养于无菌环境，室温为24～26 ℃，相对湿度为40%～60%，自然光照，自由摄食饮水，实验开展前适应性饲养1周。

2.1 造模、分组和干预

取50只大鼠建立肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠模型[5]：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定，颈部备皮消毒，取切口暴露上段气管，注射400个麦氏浊度单位的肺炎克雷伯菌标准株混悬液0.5 mL，分多次注射。剩余10只作为健康组，注射等体积生理盐水，注射后缝合切口，局部消毒。建模成功标准：大鼠反应迟缓、呆滞，胸廓快速运动，发生严重低氧血症，胸部X线片显现弥漫性渗出影。40只大鼠建模成功，随机分为模型组、穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组，每组各10只。建模后给药：穿心莲内酯低、高剂量组分别灌胃0.5、1.0 mg·mL-1穿心莲内酯混悬液(临用时取穿心莲内酯粉末，先用DMSO溶解成质量浓度10 mg·mL-1，再用生理盐水配制为实验质量浓度)，阳性对照组灌胃1.04 mg·kg-1地塞米松(用生理盐水灌服)，健康组与模型组灌胃等体积生理盐水。每日1次，连续干预7 d。

2.2 肺功能检测

末次治疗后，戊巴比妥钠麻醉，固定，颈部正中取切口，暴露气管，在第3、4气管环中间取倒T切口插管。将大鼠置入体描箱，连接呼吸机，用AniRes 2005 软件导出静息通气量、 气道阻力比值。

2.3 肺湿质量与干质量比检测

肺功能检测后，麻醉，腹主动脉采血，备用待测炎性细胞因子。脱颈处死大鼠，取右肺并沿血管、气管走向切成10 mm厚小块，选择病灶明显组织，一半装入无菌离心管液氮冷冻，保存于-80 ℃待测Western blot，一半用40 g·L-1多聚甲醛固定。取左肺称量肺湿质量，置于80 ℃烘箱烘干至恒定质量，称量肺干质量，计算肺湿干质量比值。

2.4 ELISA检测大鼠血清IL-23、IL-17水平

取腹主动脉血，室温静置2 h，4 ℃以1 500 r·min-1离心10 min，离心半径为10 cm，取上清，参考IL-23、IL-17 ELISA试剂盒说明书检测：常规设置标准孔、空白孔和样品孔，加样，温育，加酶标试剂后，加入显色剂，终止反应，450 nm波长处测定各孔光密度值，根据标准曲线计算IL-23、IL-17质量浓度。

2.5 HE染色观察大鼠肺病理学

取多聚甲醛固定的右肺组织，固定24 h后常规脱水、透明、包埋、切片，按HE试剂盒说明书染色：二甲苯透明，梯度酒精脱水，蒸馏水冲洗，苏木精染色，流水缓冲，乙醇脱术，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察，并拍照。

2.6 流式细胞术检测外周血中Th17细胞比例

取腹主动脉血加红细胞裂解液，冰浴30 min，以3 000 r·min-1离心15 min，离心半径为10 cm，收集细胞沉淀，用预冷的PBS洗涤后重悬细胞，计数，取1×106个细胞的细胞悬浮液，加入FITC-CD4、FITC-IL-17单克隆抗体，混匀后避光孵育30 min，以3 000 r·min-1离心5 min，用预冷PBS洗涤细胞沉淀，重悬，混匀后上机，用流式细胞仪检测Th17、CD4细胞百分比，计算其比值。

2.7 检测大鼠肺组织NF-κB信号通路相关蛋白表达

取液氮冷冻的肺组织，冰上研磨呈粉末，加RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白质量浓度，用Bradford调整各组蛋白质量浓度一致后进行SDS-PAGE电泳，电转膜到PVDF膜，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα和GAPDH一抗(稀释1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(稀释1∶2 000)，室温封闭1 h，滴加ECL暗室曝光显影，计算目标蛋白灰度值。

2.8 统计学方法

3.1 大鼠肺功能指标

与健康组比较，模型组静息通气量、气道阻力比值较低(P<0.05)；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组静息通气量、气道阻力比值较高(P<0.05)；
与穿心莲内酯低剂量组比较，穿心莲内酯高剂量组及阳性对照组静息通气量、气道阻力比值较高(P<0.05)；
与穿心莲内酯高剂量组比较，阳性对照组静息通气量、气道阻力比值较高(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠静息通气量、气道阻力比值比较

3.2 大鼠肺湿质量与干质量比

与健康组比较，模型组肺湿质量与干质量比较高(P<0.05)；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组肺湿质量与干质量比较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯低剂量组比较，穿心莲内酯高剂量组及阳性对照组肺湿质量与干质量比较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯高剂量组比较，阳性对照组肺湿质量与干质量比较低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺湿质量与干质量比

3.3 大鼠血清IL-23、IL-17水平

与健康组比较，模型组血清IL-23、IL-17水平较高(P<0.05)；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组血清IL-23、IL-17水平较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯低剂量组比较，穿心莲内酯高剂量组及阳性对照组血清IL-23、IL-17水平较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯高剂量组比较，阳性对照组血清IL-23、IL-17水平较低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-23、IL-17水平

3.4 大鼠肺病理学

健康组大鼠肺组织结构完整，形态正常，无炎性细胞浸润；
模型组肺泡结构破坏，肺泡腔变实，可见大量炎性细胞浸润与浆液性渗出；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组的肺泡结构完整性、形态均改善，炎性细胞浸润减轻。见图1。

3.5 大鼠外周血中Th17细胞比例

与健康组比较，模型组大鼠外周血Th17细胞比例较高(P<0.05)；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组及阳性对照组大鼠外周血Th17细胞比例较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯低剂量组比较，穿心莲内酯高剂量组及阳性对照组外周血Th17细胞比例较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯高剂量组比较，阳性对照组外周血Th17细胞比例较低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠外周血Th17细胞比例

与健康组比较，模型组大鼠肺组织p-IκBα蛋白表达水平较低，p-NF-κB蛋白表达水平较高(P<0.05)；
与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组肺组织p-IκBα蛋白表达水平较高，p-NF-κB蛋白表达水平较低(P<0.05)；
与穿心莲内酯低剂量组比较，穿心莲内酯高剂量组肺组织p-IκBα蛋白表达水平较高，p-NF-κB蛋白表达水平较低(P<0.05)。各组IκBα、p-NF-κB蛋白表达水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5、图2。

表5 各组大鼠肺组织NF-κB信号通路相关蛋白表达

注：A.健康组；
B.模型组；
C.穿心莲内酯低剂量组；
D.穿心莲内酯高剂量组。

克雷伯杆菌为最早发现的可诱发肺炎的革兰氏阴性菌，可通过呼吸道感染而引起肺炎，病理表现为肺泡扩张、炎性细胞增多[6]。克雷伯杆菌肺炎存在高耐药、并发症多等特点，目前尚无特效治疗药物。穿心莲内酯是从爵床科植物穿心莲中提取获得的二萜内酯类化合物，有抗炎、增强免疫、抗氧化、抗肿瘤等功效，且毒性低、价格低廉，广泛应用于各种炎症疾病治疗中，效果确切[7-8]。TAO Z等[9]研究表明抗炎、调节免疫是应对重症肺炎的关键，故以穿心莲内酯为实验药物，分析其对肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠的治疗作用及其机制，为该病临床治疗提供借鉴。

静息通气量、气道阻力比值为临床常用的肺功能检测指标，结果提示，与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组静息通气量、气道阻力比值升高，提示穿心莲内酯可改善大鼠肺功能。HE染色观察大鼠肺组织病理发现，与健康组比较，模型组大鼠肺泡结构严重破坏，肺泡腔有大量炎性细胞浸润，提示重症肺炎可造成严重肺部损伤，表现为肺部含水量增加。观察各组大鼠肺湿干质量比发现，与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组的肺湿干质量比较低，且病理学表现为肺泡结构、炎性细胞浸润改善，提示穿心莲内酯可减轻肺组织损伤，减轻肺泡腔炎性细胞浸润。IL-23、IL-17均属于白细胞介素，IL-17是CD4 Th17、CD8 Tc17细胞分泌的一种促炎细胞因子，在炎性环境中，CD4+T细胞将分化成Th17表型，产生IL-17，而IL-17的产生需由IL-23启动[10-11]。故IL-23/IL-17轴在炎症产生发展中相辅相成。研究结果显示，与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组大鼠血清IL-23、IL-17水平均较低，提示穿心莲内酯有抗炎作用，这可能是其减轻大鼠肺组织炎性细胞浸润的主要原因。Th17为CD4+的独特谱系辅助性T细胞，可在IL-23刺激下产生多种炎症趋化因子、细胞因子，包括IL-17，在宿主免疫反应中扮演重要角色，主要参与炎症反应自身免疫性疾病[12-13]。国内外研究报道[14-15]，Th17细胞与多种肺部疾病存在相关性，其作为前炎症细胞因子，在细菌等引起的重症肺炎中可能有致病作用。研究结果显示，与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组外周血Th17细胞比例较低，提示穿心莲内酯可通过抗炎调节大鼠免疫功能。

NF-κB是一种可特异性结合基因增强子或启动子的调节因子，在正常情况下与IκBα结合，以无活性形式存在于细胞质；
若受到刺激，IκBα降解，释放NF-κB p65，使其从细胞质转移至细胞核，调节炎症相关基因表达[16-18]。IκBα为NF-κB抑制蛋白，是IκB家族最早克隆出的、最成熟的蛋白，可在细胞因子、病毒蛋白等刺激因子刺激细胞时，级联信号快速激活IκB激酶复合物，p-IκBα21、21位赖氨酸发生泛素化降解，脱离NF-κB，从而使NF-κB核定位信号区暴露，引起NF-κB活化、核转录，介导细胞因子IL-17、IL-23等释放，诱发炎症[19-20]。结果提示，与模型组比较，穿心莲内酯低、高剂量组大鼠肺组织IκBα蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达下调，提示穿心莲内酯可能通过上调IκBα蛋白、下调NF-κB蛋白发挥抗炎作用。

综上所述，穿心莲内酯可介导IL-23/Th17平衡，增强肺炎克雷伯菌所致重症肺炎大鼠免疫功能，并减轻肺部损伤，这可能是通过调节IκBα/NF-κB通路实现的。