层次分析-熵权法联合响应面法优选参威骨痹片的提取工艺

陈 坤，李 江，彭 霜，董 芸，陈凌云，余晓玲

1.达州中医药职业学院，达州 635000；
2.云南中医药大学，云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，昆明 650500；
3.昆明市中医医院，昆明 650500；
4.普洱市民族传统医药研究所，普洱 665000

参威骨痹方是由10余味药材组成的中药复方。处方中，小红参为君药，是云南特色民族药[1]，来源于茜草科茜草属云南茜草RubiayunnanensisDiels的干燥根茎[2]，具有活血化瘀、痛经止痛、祛风除湿、镇静、镇痛等功效，用于痛经、闭经、风寒湿痹等[3-5]。威灵仙为治疗骨痹的常用中药，能祛风除湿、通络止痛。白芍等中药辅助君药养血、活血、通络、除痹；
怀牛膝、桑寄生等中药具有补肝益肾、健骨强筋功效；
桂枝、秦艽等中药祛风止痛、除湿散寒，全方共奏活血化瘀定痛、补益肝肾、祛风除湿之功效，临床上主要用于风湿痹症[1]，用药后症状改善明显，有效率达82%[6]。但为更适宜临床用药需求，使患者顺应性更好，避免临时煎服等缺点，本方拟开发医疗机构制剂参威骨痹片。课题组前期已经完成参威骨痹片的制备工艺及质量标准研究，且对其药效学进行了初步研究，结果表明参威骨痹片对膝关节炎模型大鼠关节液中TNF-α有明显的有抑制作用，提示对骨关节炎有治疗效果[1]。而本文旨在阐述参威骨痹片提取工艺的优选方法，为参威骨痹片的生产提取提供数据支持。

层次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)为主观赋权法，是通过分析复杂系统中涉及的因素及其相互关系，构造复杂系统AHP法的结构模型，将各层次的要素成对比较，得出某一层次相对重要性的比较尺度，建立判断矩阵，以最大特征值和特征向量得到相应排序，从而确定权重向量[7-8]。信息熵权重法(Entropy Weight Method，EWM)为客观赋权法，用于衡量指标的离散程度，离散度越大，指标对综合评价的影响就越大[9]。熵是不确定性的度量。信息量越大，不确定性和熵就越小。信息量越小，不确定性和熵就越大[10]。AHP法源于决策者的主观抉择，而熵权法则侧重于数据本身所蕴含的客观信息，科学的权重系数应该是主客观相结合的结果，AHP-EWM联合使用，既避免了AHP法的主观抉择，又有效利用数据本身的客观信息，使得到的权重系数更为合理，更符合实际运行的需要[11-12]。本文以参威骨痹片提取为例，用AHP-EWM法确定各指标权重系数，有利于保证改进剂型的临床疗效，为中药复方提取、剂型改进提供新思路。

1.1 仪器

高效液相色谱仪、C18色谱柱、分析天平、电子天平、数显恒温水浴锅参照《熵权法联合Box-Behnken响应曲面法优选复方龙血竭双层膜中黄连提取工艺》一文中仪器设备[10]。

1.2 试药

龙胆苦苷(批号为110770-201013，质量分数为98.5%)、芍药苷(批号为110736-201842，质量分数为98.8%)均购于中国食品药品检定研究院；
各饮片由云南中医药大学第三附属医院(昆明市中医医院)提供，并由云南中医药大学陈凌云教授进行鉴定[小红参(批号210501)、独活(批号210201)、桑寄生(批号210501)、威灵仙(批号210401)、防风(批号210301)、当归(批号210501)、秦艽(批号210501)、桂枝(批号210501)、盐杜仲(批号210401)、川芎(批号210502)、牛膝(批号210201)、茯苓(批号210501)、甘草(批号210501)、白芍(批号210501)、灯盏细辛(批号210302)、熟地黄(批号210501)]；
乙腈(色谱纯，批号6081001004，美国Sigma-Aldrich公司)；
水为娃哈哈纯净水；
其余试剂均为分析纯。

2.1 色谱条件

柱温设定为30 ℃；
流动相为乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)；
流速为1 mL·min-1。梯度洗脱(0～2 min，12.0%A；
2～3 min，12.0%～15.0%A；
3～6 min，15.0%A；
6～7 min，15.0%～20.0%A；
7～15 min，20.0%A；
15～16 min，20.0%～60.0%A)[13]。波长切换：0～15 min在230 nm处测定芍药苷，15～30 min在275nm处测定龙胆苦苷；
进样量为10 μL。理论板数按芍药苷峰、龙胆苦苷峰计算分别不低于2 000、3 000。

2.2 溶液的配制

对照品溶液的制备：取芍药苷、龙胆苦苷对照品，精密称定，加甲醇溶解并分别稀释成274、312 μg·mL-1的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取处方比例药材，根据Box-Behnken实验安排，回流提取，滤液适当浓缩，用250 mL量瓶定容，精密吸取10 mL，置于干燥蒸发皿中，挥干，残渣加甲醇30 mL使溶解，超声30 min，加甲醇定容至50 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：按照处方比例分别制成缺白芍、秦艽的阴性样品及两药均缺的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性考察 参照文献方法[10]进行专属性实验。结果显示，对照品溶液和供试品溶液中芍药苷、龙胆苦苷色谱峰保留时间一致，且阴性对照品溶液在相应位置处无相同吸收峰，表明专属性良好。见图1。

2.3.2线性与范围 按2.2项下方法配制混合对照品溶液，得芍药苷、龙胆苦苷对照品溶液质量浓度分别为688.80、735.60 μg·mL-1。并精密吸取1、2、5、5、8 mL混合对照品储备液，分别定容至25、25、25、10、10 mL量瓶中，得芍药苷对照品溶液质量浓度分别为27.55、55.10、137.76、344.40、551.04 μg·mL-1及龙胆苦苷对照品溶液质量浓度分别为30.144、60.288、150.72、376.8、602.88 μg·mL-1，按2.1项下色谱条件测定，以峰面积值为纵坐标(y)，以进样质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)进行线性回归，分别得芍药苷、龙胆苦苷线性回归方程分别为y=0.105 2x+0.469 8(r=0.999 9)，y=0.141x+0.492 7(r=0.999 9)，结果表明，芍药苷和龙胆苦苷分别在进样质量浓度27.55～688.80 μg·mL-1、30.144～735.60 μg·mL-1范围内与其峰面积呈良好线性关系。

2.3.3精密度 参照文献方法[10]进行精密度实验。计算得芍药苷、龙胆苦苷峰面积的RSD值分别为0.02%、0.13%(n=6)。结果表明，该仪器精密度良好。

注：A.芍药苷、龙胆苦苷对照品溶液；
B.供试品溶液；
C.缺秦艽阴性对照溶液；
D.缺白芍阴性对照溶液；
E.两药均缺阴性对照溶液；
1.芍药苷；
2.龙胆苦苷。

2.3.4稳定性 参照文献方法[10]进行稳定性实验。经计算，混合对照品溶液中芍药苷、龙胆苦苷峰面积的RSD分别为0.23%、0.39%，供试品溶液中芍药苷、龙胆苦苷峰面积的RSD分别为1.35%、1.17%。结果表明，混合对照品溶液与供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5重复性 参照文献方法[10]进行重复性实验。并计算含量，得RSD值分别为1.77%、1.54%(n=6)，结果表明，该实验方法重复性好。

2.3.6准确度实验 精密吸取同一份已知含量的供试品溶液共9份，每份1 mL，分别按1∶0.5，1∶1，1∶1.5比例，参照文献中稳定性考察方法[10]进行准确度实验。计算得芍药苷、龙胆苦苷得平均回收率分别为99.65%、99.54%，RSD 值分别为0.38%、0.75%。表明该方法加样回收率良好[10]。见表1。

表1 芍药苷、龙胆苦苷加样回收实验结果

2.4 干膏得率

参照文献方法[14]进行提取物干膏制备实验，计算干膏得率。

2.5 层次分析法(AHP)计算权重

层次分析法是一种定性与定量相结合的科学决策方式。它对定性问题进行量化评价，依靠决策者的主观经验对各评价指标进行判断[15]。处方中，小红参作为君药，主要成分为蒽醌类化合物，其中明确的蒽醌类化合物有16个[16-19]，小红参主要有抗癌作用[20]，小红参含药血清能够明显抑制T淋巴细胞对链球菌抗原的增殖作用、抑制NO的产生等[21]。臣药白芍的有效成分为芍药苷，白芍具有镇痛、抗炎[22]、抗菌[23]、抗氧化[24]、抗癌[25]、抗抑郁[26]和抗肝纤维化[27]作用。此外，白芍对自身免疫系统疾病、神经退行性疾病和心脑血管疾病都有一定治疗作用[28]；
作为佐药的秦艽主要含有环烯醚萜苷类和黄酮类化合物，临床上主要治疗骨关节炎[29-30]；
干膏得率可间接反映其他药物的提取量，也是片剂制备的主药原料。在遵循中医药君臣佐使配伍理论及现代药理作用的基础上，将3项指标分成2个层次，并确定各指标的优先顺序为：芍药苷>龙胆苦苷>干膏得率。用AHP理论中1～9标度法对3项指标进行两两比较，列举各评价指标的判断优先矩阵，见表2。再按几何平均法计算各指标的权重系数，得干膏得率、芍药苷和龙胆苦苷的权重系数分别为15.132%、47.196%、37.672%。并对本次求得的各个权重系数进行一致性检验，得CI(一致性指标)=0.027≠0，CR(随机一致性比率)=0.052<0.1，说明评价指标层的判断矩阵和单排序结果通过了一致性检验，所求得的权重系数有效[31-32]。

表2 3种指标成分成对比较矩阵

2.6 信息熵权重法(EWM)计算权重

设响应曲面实验原始数据为矩阵(Yij) ，将其用极值法[公式(1)]进行处理 ，转为(0，1) 之间的数值得到响应原始矩阵[33-34]。根据公式(2) 、(3) 计算各指标信息熵Hij=[0.997 6，0.996 5，0.998 5]，得干膏得率、芍药苷、龙胆苦苷3个指标权重系数分别为29.46%、48.95%、21.59%。

(1)

(2)

(3)

2.7 AHP-EWM混合加权法确定权重

经计算，AHP与信息熵指标权重相关系数为0.508，单因素方差分析结果为P=0.018(大于0.01小于0.05)，说明两组权重数据相关性显著，而非极显著。根据复方主治功效及组方比例的特点，用AHP法量化了评价指标两两比较判断的优先信息，主观评价了各指标的权重系数，基本体现了复方君臣佐使配伍规律及各成分对总体效果贡献的主次顺序[35]，而信息熵权法的权重完全依据客观的实验数据，能真实地反映提取制备过程有效部位量值传递变化的客观规律，因此，科学的权重确认原则应兼顾主观权重和客观权重。实验用AHP-信息熵权法计算综合权重Mi，计算公式为公式(4)。通过计算，3个评价指标的综合权重分别为12.49%、64.72%、22.79%。

Mi=Wi-AHPWi-EWM/∑Wi-AHPWi-EWM

(4)

2.8 提取工艺优化

2.8.1因素水平设计与结果 参照文献方法[10,14]设计实验因素水平(课题组前期已完成该批次白芍、秦艽药材含量的测定，其中芍药苷、龙胆苦苷含量分别为4.69%、3.27%)，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理进行实验设计，各因素与水平见表3。实验设计方案、结果见表4[10,14]。

表3 实验因素与水平

表5 回归模型的方差分析

2.8.2响应面分析与优化 响应曲面图和等高线图可准确直观地反映出提取过程中各因素与响应值的交互作用。对综合评分进行影响程度大小排列分析，分析结果显示，提取次数、提取时间交互作用显著，加水倍数、提取时间、加水倍数和提取次数交互作用结果不显著，结论与方差分析结果一致[10]。见图2。

2.8.3提取工艺的验证 由上述结果可知，加水量为10 倍、提取时间为2 h、提取次数为3 次为此次提取工艺优化的最佳结果，综合评分理论值为99.99。参照文献中的提取工艺验证方法进行验证实验[10,14]。验证结果见表6。

图2 响应曲面图和等高线图

表6 提取工艺验证实验

由表6可知，干膏得率、芍药苷及龙胆苦苷转移率均合理，综合评分接近预测值，工艺稳定可行，具有重复性和可操作性，证明优选条件可行[10]。

在设计提取方法时，因本方为云南省名中医江顺奎教授的经验方，临床使用长期有效，又拟制备院内制剂，故全方用水提取。本方药味较多，民族药小红参为本方君药之一，化学成分多为不明确的蒽醌类化合物，因其含量指标未被《中国药典》收录和量化，同时，课题组对复方提取液做了大黄酸、大黄素、大黄酚和芦荟大黄素等常见蒽醌类化合物检测，均未能检出，故未作为评价指标；
另一味君药威灵仙，依照2020年版《中国药典》规定对齐墩果酸进行含量测定，经检测，齐墩果酸存在阴性干扰，亦未纳入评价指标。本方中当归、川芎、独活等含挥发油类，受热易分解，且不易保存；
尚含有桑寄生等《中国药典》未收录含量测定项的中药，暂不作为评价指标，而臣药白芍具有镇痛、抗炎等作用，佐药秦艽主要含有环烯醚萜苷类和黄酮类化合物，临床上主要作为治疗骨关节炎的常用药。综合考虑，选择臣药白芍中的芍药苷和佐药秦艽中的龙胆苦苷作为评价指标，考虑到本方药味众多，成分复杂，选择芍药苷、龙胆苦苷及干膏得率三者共同作为评价指标。

参威骨痹方化学成分复杂，其评价指标的有效性、可测性、特有性3个核心属性则决定临床疗效。本文围绕参威骨痹方的3个核心属性首次用AHP-EWM法进行其提取分析，若单纯采取一种评价指标，则并不能完全控制其质量标准；
若采用多标志物统一评价，则各指标之间的权重系数则会依靠人为的主观抉择。AHP法是根据行业专家对这3个核心要素重要性的认识而打分确定，具有一定的主观性；
EWN法的评价完全居于数据本身的客观性，两法合用，使得到的权重系数更为合理，更符合实际运行的需要，为后续参威骨痹片的成型工艺、药效学及生物利用度研究奠定基础。同时，本文所构建的AHP-EWM法对于复方提取质量的综合评价具有较好的普适性，为中药复方的提取评价提供新思路。