陕西不同核桃品种指纹图谱构建

靳玲兵，高天健，李一杰，赵昕驰，彭少兵*

(1.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵 712100；
2.陕西省核桃工程技术研究中心，陕西 杨陵 712100)

核桃(Juglansregia)是核桃属(Juglans)一种经济价值显著的木本粮油树种，核桃属有20多个种，中国是核桃起源地之一，至今已有2 000多a的栽培历史[1]，在长期栽培过程中，我国选育出的核桃品种及类型超过500多个[2]，可供遗传改良的核桃种质资源日渐丰富。陕西核桃种植面积已超过6.67×105hm2，是中国核桃主产大省之一，随着核桃种植面积快速扩大，引入和培育的核桃种质资源也越来越丰富，不同地区之间相互传播和本地自然杂交形成遗传多样、变异复杂的品种和类型，导致全省核桃品种繁多混杂，难以区分。同时，种植面积广泛却单产低、良种利用率不高、品种混杂成为制约当地核桃产业发展中的重要问题之一[3-4]。因此，建立一套准确高效的核桃品种资源鉴别方法，对核桃良种的生产推广、品种登记和产权保护等具有重要意义。

分子标记是一种可以在DNA水平上直接体现多态性的高效遗传标记。因检测方法准确，周期短，材料不受生长发育时期、来源部位及环境条件限制，近年来得到了快速推广应用[5]。目前SSR(微卫星标记)和SNP(单核苷酸多态性技术)分子标记是公认构建指纹图谱数据库的优良标记方法。这2种标记方法各有优势,SNP数量多，分布广泛，适用于快速、规模化筛查，相对成本高。SSR具有多态性丰富、共显性、扩增稳定、获取的信息含量高、简单便捷等优点[6-8]，且SSR分子标记引物数量少，适合少量样本检测，所要求的实验平台条件较低，已被广泛应用于枸杞[9]、杨树[10]、榛子[11]、枣[12]、苹果[13-14]等植物指纹图谱构建及遗传多样性分析等方面。

近些年来，国内关于核桃资源的SSR研究日益增多。敬丹等[15]利用SSR标记对分散于全国的78份核桃农家品种及部分栽培种的遗传多样性进行分析，发现农家品种与栽培种以及不同地理来源的核桃品种界限不明显；
吴涛等[16]以基于SSR标记分析的云南省核桃资源的遗传多样性数据，构建了云南省核桃种质资源的核心种质；
周贝贝等[17]采用SSR分型技术建立了核桃亲子鉴定方法，为核桃育种中解决亲本不清问题提供了新的参考手段；
彭少兵等[18]利用SSR技术分析了安康串状核桃的起源及亲缘关系。本研究选用陕西省栽培面积较多的本土培育核桃品种21个，综合考虑检测成本和高效准确两方面的因素，在利用传统聚丙烯酰胺凝胶电泳初步筛选SSR引物之后，再使用毛细管电泳检测方法，采用荧光SSR分子标记进行核桃品种资源鉴别，分析不同供试核桃材料间的遗传多样性，使检测结果更加精准、高效，利用所获得的可以区分供试核桃品种的SSR标记构建核桃品种指纹图谱，以期为核桃品种的快速、准确鉴定和地方核桃品种产权保护、生产应用以及下一步进行杂交育种提供一定的参考依据。

1.1 试验材料

供试的21份核桃材料(表1)均采自西北农林科技大学山阳核桃试验示范站，是陕西核桃栽培和利用的主要品种，于2020年夏季采集各个核桃品种新抽生的较嫩叶片，装入自封袋中及时用冰盒带回实验室，编号后置于-80 ℃冰箱中保存。

表1 供试材料

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 使用植物DNA提取试剂盒(TaKaRa)提取供试核桃叶片DNA，经1%琼脂糖电泳和NanoDrop 2000核酸测定仪检测质量后，将DNA浓度稀释至25 ng·μL-1，用0.5 mL离心管分装后放入-20 ℃冰箱，用于后续PCR扩增试验备用[19]。

1.2.2 SSR引物筛选 根据已发表文献[23]选择20对SSR引物，委托西安擎科生物公司合成。PCR反应体系总共20 μL，其中含有10 μL Taqmix(TIANGEN)，上游引物、下游引物各1 μL，模版DNA 2 μL，加ddH2O 6 μL补足。反应程序：95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；
72 ℃延伸8 min。随机选择部分核桃品种为模板，吸取2 μL PCR 产物，采用8%聚丙烯酰胺凝胶进行引物初筛。使用210 V稳压电泳2～2.5 h，在蓝色指示剂距离底端1 cm时停止电泳。电泳结束之后在65 r·s-1的水平摇床上银染显色，过程如下：将带有凝胶一面的玻璃板依次放入固定液(蒸馏水∶无水乙醇∶冰乙酸=280∶20∶1)和0.1%的AgNO3溶液中各10 min；
最后放入显影液(1.5%的NaOH溶液，4 ℃冰箱预冷，使用前加入2 mL甲醛)轻晃至条带清晰出现时，停止显色并拍照[18]。最终筛选出6对多态性丰富、扩增效率好的SSR引物(表2)。

表2 SSR引物信息

1.2.3 毛细管电泳荧光检测 对筛选出的6对SSR引物的正向5′端用6-FAM荧光集团进行修饰，SSR-PCR反应体系共25 μL，其中包括模板DNA 1 μL(25 ng·μL-1)，上游引物0.5 μL(10 μmol·L-1)，下游引物0.5 μL(10 mmol·L-1)，dNTP 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10×Taq Buffer(MgCl2)2.5 μL，Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1)，加 ddH2O补足。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃修复延伸10 min。电泳体系中包含PCR产物1 μL、分子量内标(LIZ 500)0.1 μL和去离子甲酰胺9.9 μL。98 ℃变性5 min，冷却离心后使用ABI 3730XL型 DNA分析仪进行检测。引物标记与电泳检测均由上海生工生物技术公司完成。

1.3 数据统计分析

使用Genemapper软件读取SSR片段数据并录入Excel 2010，运用DateFormater将数据转换成相关软件可以识别的格式，利用PopGen32软件计算观测等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon信息指数I等遗传多样性相关指标。同时利用NTSYSpc2.10软件计算21个核桃品种间的遗传相似系数，最后绘制UPGMA聚类[20]。

2.1 DNA提取

提取的DNA经检测(图1)，显示其DNA条带清晰、无拖带、无降解弥散，OD260/280在1.8～2.0，表明DNA质量较好，可用于后续试验。

注：M.标记基因DL 2 000 DNAladder；
编号1～21同表1。

2.2 SSR标记多态性分析

从20对引物进行预试验筛选出6对多态性丰富、扩增效率好的SSR引物，检测结果表明(表3)，6对核心引物在21份核桃品种中共扩增出54个等位变异，扩增范围为7～11个，平均各对引物检测位点9个；
引物WJR031、WJR265、WJR281、WGA032、WGA321、和WGA331检测出清晰的等位基因数分别为9、10、7、11、9个和8个，其中，引物WGA032扩增出的等位基因数最多，引物WJR265次之，引物WJR281扩增出的等位基因数最少。有效等位变异(Ne)变化范围为3.737 3～5.690 3，平均为4.459 9；
Shannon’s信息指数(I)变化范围1.628 7～1.871 5，平均为1.790 1；
说明供试核桃品种间具有较为丰富遗传多样性，选用的6个SSR标记在参试核桃品种间多态性较高。

2.3 品种鉴定与指纹图谱构建

根据6对SSR引物的扩增结果，经不同标记间相互组合，只需选取3对引物即可区分出21份供试核桃材料。第1步使用引物WJR265，可直接区分出供试材料中的10个核桃品种，剩余11个品种分为3组；
第2步使用引物WGA331，可直接将‘辽核1、3、4号’、‘中林5号’和‘土奈尔’组，‘香玲’和‘清香’这2组材料分别逐一区分，另一组‘巨丰’、‘西林2号’、‘西扶1号’和‘西扶2号’这4个材料中，仅不能区分‘西扶1号’和‘西扶2号’2个品种；
第3步使用WJR031、WJR281、WGA321或WGA032中的任何一个引物，即可区分最后2个品种，有4种不同组合。21个核桃品种具有各自特定的SSR指纹图谱(表4)，图2为标记WJR265对部分核桃品种的毛细管电泳荧光检测结果，在生产应用中为核桃品种鉴定提供重要依据。

图2 标记WJR265对部分核桃品种的检测结果

表3 SSR多态引物相关指标

2.4 品种间遗传关系聚类分析

统计6对引物对21个核桃品种的SSR检测结果，采用DateFormater将Excel数据保存为NTSYSpc2.10软件可以识别的格式，计算不同品种之间的遗传相似系数(表5)。从表5可知，21份核桃品种的GS值为0.59～0.93。其中，‘辽核1号’和‘辽核3号’间的GS值最大，为0.93，表明这2个核桃品种之间的遗传差异最小，亲缘关系最近；
‘契可’和‘西林2号’之间的GS值最小，为0.59，表明二者的遗传多样性相对较广，亲缘关系较远。

用21个品种相似系数数据，选择NTSYSpc 2.10软件clustering菜单下的SAHN选项计算相关作图数据，最后点击graphics菜单下的tree plot选项，绘制出21个品种树状聚类图(图3)。聚类结果可知，约以GS值0.745为阈值，21份核桃材料被分为3个类群(SSR groups,Sg)，SgⅠ类群的5个品种中除‘辽核4号’以外，其余均为美国引进的主栽品种，占供试材料总数的24%。SgⅡ类包括15个品种，占供试材料总数的71%。SgⅢ类只有紫仁1个品种，占供试材料总数的5%。约以GS值0.776为基准，可以将SgⅡ类群分为SgⅡ-1、SgⅡ-2和SgⅡ-3这3个亚群，SgⅡ-1包括‘西扶1号’、‘西扶2号’、‘串状核桃’、‘西洛2号’、‘香玲’、‘西林3号’、‘中林5号’、‘温185’和‘元丰’9个核桃品种；
SgⅡ-2类群中，‘清香’为日本引进的晚实核桃品种，‘辽核1号’和‘辽核3号’亲本相同，且亲本中具有晚实品种；
SgⅡ-3包括‘巨丰’和‘西林2号’，均为新疆核桃实生后代。聚类结果与供试材料的遗传来源较为符合。

表4 21个核桃品种的SSR指纹图谱

表5 21份供试样本间的遗传相似系数

图3 基于6对SSR引物的核桃种质资源聚类分析

在利用SSR标记鉴定核桃品种时，将6对引物采用4种不同的引物组合方法，每3对一组对21个陕西主栽核桃品种进行了品种鉴别和指纹图谱构建研究，说明了SSR荧光标记技术可以有效地用于核桃品种资源指纹图谱构建及遗传关系研究，并在其基础上简单分析了供试材料的遗传多样性，结果发现目前这些核桃主栽品种之间的遗传相似度较高。

随着核桃种质资源的不断丰富，品种日益增多，进行品种区分和鉴定对于核桃良种选育、增产增收十分重要。陕西核桃种植面积大，栽培集中，品种繁多混杂，缺乏经验者往往难以通过果形、枝条、叶片等传统形态学方法鉴定核桃品种，更因受环境、物候期、时间等因素影响难以及时得到准确鉴定结果。在不同群体间，由于基因组中简单重复序列的大小和拷贝数不同，SSR标记可以通过不同长度多态性片段来区分近缘种间关系，在植物品种资源鉴别和DNA指纹数据库构建上具有独特的优越性。

利用SSR标记进行品种鉴定，筛选引物至关重要。毛细管电泳技术具有高效、精确、污染少、自动化等优点，能更好地减少试验过程中的人为和系统误差。周于波等[4]利用SSR毛细管电泳检测技术对四川地区29个核桃良种进行分析，11对引物共检测到80个等位基因121个基因型,各引物等位基因数为5～12，筛选出的高多态性引物运用于四川核桃遗传多样性研究。但对多对引物进行荧光标记则引物成本较高，影响实际应用，为了筛选出多态性高的SSR引物，本研究首先随机选取部分核桃品种利用8%PAGE检测进行引物初筛，将从20对引物中筛选出的6对多态性高的SSR引物用荧光染料标记，再利用毛细管电泳技术检测，发现区分核桃品种数最少的引物WJR031，也可将供试材料分为9组，充分体现了SSR标记用于核桃品种鉴定的高效性。理论上讲，使用的标记数量越多，聚类分析出来的结果越准确。本试验选用的6对引物共检测到54个等位基因，各引物等位基因数为7～11，平均每对引物检测位点9个，能很好地用于对21份供试核桃材料的鉴定，与史丽会等[2]、杨本芸等[3]关于核桃微卫星标记的研究相比，本研究所用引物鉴别能力更强，辅以荧光标记检测法，只需3对引物即可鉴别全部供试材料，效率高、成本低，可进一步为核桃种质资源鉴定提供参考。

陕西是我国核桃种植大省，在种质资源的管理、保存、交换和利用等过程中，因品种混杂、纯度降低造成的低产减产、良种利用效率低下的情况不在少数，明确优良核桃品种真实性，对种质资源进行遗传关系和身份鉴定是一个较为繁琐的工作[21]，DNA指纹技术是对植物品种进行鉴定和分类的重要依据。本研究在肖志娟等[22]、陈凌娜等[23]基于ISSR和SSR技术分析核桃资源遗传多样性的基础上，用筛选出6对高效的SSR引物加以荧光修饰，选用其中3对引物快速鉴定供试核桃品种资源后，构建了陕西地方核桃品种指纹图谱，成本低，方法简便易行，获得的分子图谱可以作为核桃品种鉴定的依据，补充核桃指纹图谱数据库，并为后续科研工作提供参考，为核桃品种的分类和利用进一步提供了分子依据。