猪圆环病毒病的流行病学与实验室诊断技术

张洪钢，李志美

（山东省诸城市畜牧业发展中心 山东潍坊 262200）

随着我国经济水平的不断提高，国民对于猪肉及其相关制品也提出了新的要求，健康养殖成为当前生猪养殖业必然的发展方向，因此做好生猪养殖过程中各类疫病的防控工作极为重要。猪圆环病毒病是由于生猪感染猪圆环病毒后引发的一类猪多系统功能障碍性疾病，主要引发患病猪只体质明显下降、腹泻、呼吸困难以及消瘦衰弱等情况，该病是继猪蓝耳病后的又一猪类重要传染性疫病，是全球公认的可对生猪养殖业造成危害的重要疫病，被我国列为二类动物疫病。近年来，随着外来猪种的不断增加，该病的感染率与发病率也呈现逐年升高的趋势，猪圆环病毒主要引起生猪机体的免疫抑制以及严重的呼吸系统和消化系统损伤，可导致患猪的饲料转化率降低、生育繁殖能力受到影响和较高的死亡率，给养殖户带来严重的经济损失。了解猪圆环病毒的流行特点，做好该病的预防工作，对猪场内的患猪及时做出诊断、治疗，对降低该病造成的损失具有重要意义。

猪圆环病毒（PCV）是本病的主要致病原，该病毒是一种单股的DNA 病毒，属于圆环病毒科，圆环病毒属，当前已发现有4 种亚型，其中PCV1 不具有致病性，PCV2 和PCV3 具有致病性，目前尚未确定PCV4 是否能够致病。猪圆环病毒病主要是由PCV2 导致的，该病毒没有囊膜和血凝性，外形呈现20 面体对称，病毒粒子的直径在12～23nm 之间，是最小的动物病毒之一。猪圆环病毒对酸性和高温环境的耐受性较强，可以在pH 值为3 的酸性环境中保持活性，在75℃的环境下加热15min 后仍具有活性，同时也对碘酒和氯仿等消毒制剂具有较强的抵抗力，但猪圆环病毒对戊二醛等氧化剂比较敏感，具有较好的杀菌效果。

猪圆环病毒病的流行范围比较广泛，可在全球范围内流行，猪是PCV2 的自然宿主，尚未发现猪圆环病毒对其他动物以及人类的感染报道。该病无季节特征，一年四季均可感染发病，并且任何日龄的生猪均对本病易感，但对哺乳期及保育期的仔猪危害更严重，尤其5～8 周龄的仔猪多见，通常仔猪断奶后的2～3d 或1 周内开始发病，成年猪则呈亚临床经过。该病主要通过接触传播，可通过消化道和呼吸道进行水平传播，也可以通过配种、胎盘或者胚胎移植等途径垂直传播给仔猪，患病猪只以及隐性感染的生猪是该病的主要传染源，其次，健康猪只接触到被猪圆环病毒污染的人、动物、器具、设备或者车辆等也可以导致其直接或者间接的感染。猪群感染该病后的发病率为20%～60%左右，死亡率约为5%～35%，有时也可达到50%。诱发猪圆环病毒病的原因较多，PCV2 感染并不是唯一的病因，外界环境、温度、饲料、免疫、应激因素或者发生协同感染后均可诱导该病发生。

3.1 病毒分离鉴定试验

无菌条件下采集病死患猪的肺脏或者淋巴结等器官组织，研磨后制成混悬液，然后在-20℃的环境下反复冻融、离心，取出上清液后使用过滤器除菌，然后将其接种到已经长成单层并且未被PCV 污染的PK-15 细胞中，在37℃的环境下培养24h，此后将细胞培养液倒掉加入无菌PBS 进行洗涤，待清洗干净后加入浓度为2%胎牛血清的DMEM 细胞维持液，再在37℃的环境下继续孵育48～72h，待连续盲传3 代后，可对其进行猪圆环病毒抗原或者核酸检测。该分离鉴定方法比较耗费时间，不适用于养殖场内疾病的快速诊断[1]。

3.2 血清学检测技术

1）酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA 检测方法的原理首先是将猪圆环病毒的抗原或者抗体吸附到固相载体上，然后对其进行免疫酶染色，待底物显色后可以使用酶标仪测定或者肉眼直接观察结果的一种检测方法。这种检测方法具有敏感性强、检测速度快以及特异性高等特点，并且可以用于一次性大批量的检测样品，是当前实验室检测应用最为广泛的，也是发展最快的诊断方法之一。在实际检测中可在无菌条件下采集患猪或者病死猪的血液，制备成血清后使用猪圆环病毒病ELISA 诊断试剂盒，按照说明书进行相关的实验操作，待底物显色后使用酶标仪，选择630nm 的波长测定反应物的OD 值，如果OD 值大于0.4，则该样本为阳性，如果检测值在0.2～0.4 之间，则将其判定为可疑样本，如果OD 值小于0.2，则可判定样本为阴性。

2）竞争性酶联免疫吸附试验（C-ELISA）。2000 年，Walker 等[2]利用细胞培养的PCV2 作为抗原，同时使用PCV2 的特异性单克隆抗体作为竞争试剂，建立了C-ELISA 检测方法，实践表明这种检测方法具有较高的检出率，可高达99.58%，明显高于间接免疫荧光法（IFA）的检出率（97.14%），较免疫荧光法检测方法更为敏感，并且其可用于大批量的猪圆环病毒检测。

3）间接免疫荧光试验（IFA）。该试验方法属于特异性的血清学诊断方法，主要是对猪圆环病毒分离效果的鉴定以及对患猪病变组织的检测或者猪源细胞的猪圆环病毒感染情况等，既可以用于检测群特异性抗原，又可以用于检测型特异性抗原。在实际诊断中可将采集的患猪病料接种PK-15 细胞，或者将病变的组织直接冰冻切片后，使用丙酮进行固定，然后再使用兔抗高免血清和细胞培养物进行反应，同时设置一组没有被猪圆环病毒感染的正常的PK-15 细胞，或者正常的组织制备成切片作为对照组，即可对猪圆环病毒进行相应的检测及定型。若在对细胞或者切片镜检时出现了特异性的荧光反应，则可以说明该病料中存在猪圆环病毒，即可将其判定为阳性。IFA 检测法操作较为简单、快速，并且这种方法的花费较小，在实验室诊断当中也较为常用。

4）免疫胶体金技术（ICGT）。这种检测方法将红色胶体金作为标记物，使用微孔滤膜作为载体，经过3～5min 的渗滤反应，逐步完成整个反应过程。经ELISA 法验证后表明这种检测方法具有较强的蛋白免疫原性，可以准确地鉴别出PCV2 的阳性血清以及标准的阴性血清，并且与猪的其他病毒血清没有免疫交叉反应，ICGT 的检测灵敏度和ELISA 法较为相似。

5）免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）。IPMA 检测方法是通过在96 孔板上长有PCV 的PK-15 单层细胞上，加入1:10 稀释后的待检测的猪血清，待反应一段时间后将其吸干、洗涤，然后加入经辣根过氧化物酶（HRP）标记的猪IgG 抗体，在37℃的环境中孵育30min，再次吸干、洗涤，然后加入底物溶液进行显色反应，最后终止反应即可对血清中的抗体进行检测。利用这种检测方法对PCV2 的检出率较高，可达80.5%左右。经过后期的不断改进，IPMA抗体检测试剂盒可以更加快速、简便的检测出PCV2，并且具有较高的特异性和敏感性[3]。

3.3 分子生物学诊断技术

1）常规PCR 技术。常规PCR 技术是通过参照PCV2 的基因序列，设计出特异性的PCV2 引物，将患病猪只病料中的PCV2 基因进行扩增，最终根据扩增产物判断出该病料中是否具有猪圆环病毒。这种检测方法操作简便、快速、特异性强，并且敏感性较高，在实验室诊断当中应用较为广泛。

2）套式PCR 技术。套式PCR 技术有效解决了病料组织或者细胞当中PCV2 的浓度太低，使用常规PCR 技术不能准确检测到PCV2 基因组的缺点。这种检测PCV2 的方法较常规PCR 技术具有更高的敏感性。

3）荧光定量PCR 技术（RT-PCR）。这种检测方法是在常规的PCK 体系中加入荧光基团，通过实时监测荧光信号的积累对整个的PCR 进程进行监测，最后再利用标准曲线对未知的模板定量分析。RT-PCR 检测法具有较高的灵敏度和特异性，并且检测的稳定性较好，比传统PCR 技术检出的阳性率高出14.3%，已经逐步替代传统PCR 检测技术，成为实验室常用的病原微生物诊断技术。

4）PCR 限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）。该方法属于多态性分析法，充分考虑到了生物在进化过程中，由于基因序列的改变而导致的限制性核酸内切酶的识别位点的改变，通过不同猪圆环病毒毒株间酶切位点及其保守性的差异，区分出不同地区来源的病毒毒株。

5）原位杂交技术（ISH）。这种检测方法是由细胞学、分子生物学以及组织化学相结合所组成的检测技术，主要利用碱基互补顺序的特点，通过碱基互补形成稳定的杂交双链，其敏感性较强，可以准确定位到位PCV、PCV 及猪蓝耳病病毒DNA 或RNA 在细胞中的部位[1]。

6）基因芯片检测技术。该检测方法是由微电子学以及分子生物学等多个学科相结合形成的高科技检测技术，可以准确地鉴别出猪圆环病毒的基因型，同时还能鉴别出猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的感染，具有灵敏度高、特异性强以及可重复的特点。

综上所述，猪圆环病毒病对生猪养殖业的危害巨大，饲养人员深入了解猪圆环病毒病的流行特点，并结合实际情况选择适宜的诊断技术及时对本病做出确诊，对有效防护该病的蔓延和传播具有重要的意义。