基于HPLC指纹图谱、多指标成分含量测定结合化学计量学的怀牛膝质量评价*

王彦夫，刘 艳，杨琬琪，匡海学，杨炳友

（黑龙江中医药大学教育部北药基础与应用研究重点实验室 哈尔滨 150040）

牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，主产于河南，全国各地均有栽培，道地产区为河南省焦作市，为“四大怀药”之一，习称其为怀牛膝。2020版《中国药典》[1]记载其具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功效。临床上常用于急性咽炎、高血压、痛风性关节炎、引产、功能失调性子宫出血等症。

国内外研究报道表明牛膝根内含有皂苷类、甾酮类、多糖类、生物碱等成分[2-7]。其中，甾酮类化合物为牛膝的主要成分之一，具有抗肿瘤、镇痛抗炎、抗骨质酥松等活性[8-10]。牛膝药材质量受多因素影响，不同产地的牛膝药效有显著差异，这可能是因为不同产地的牛膝所含的化学成分不同或其部分化学成分的含量有所不同。

含量测定为历代《中国药典》中判定药材质量的常用方法，具有方法简单、成本低、易操作等优点[11]，现2020版《中国药典》中对牛膝的质量标准仅以β-蜕皮甾酮含量判断不够全面。随着中药指纹图谱的研究越来越深入，将指纹图谱作为质量控制的方法得到了广泛应用，中药指纹图谱可对成分复杂的中药材及制剂，进行色谱分析得到丰富的化学信息，从而实现对不同中药材及制剂的质量控制[12]。化学计量学的出现及应用更是将指纹图谱中所包含的化学信息提取并数字化，可对大量样品进行全面准确的鉴别归类，为中药材的质量控制提供了极大的便利[13]。因此本实验通过多指标含量测定并建立HPLC指纹图谱，结合化学计量学对河南省不同产地的怀牛膝药材建立更加全面的怀牛膝质量评价方法，为怀牛膝的质量评价提供参考。

万分之一电子分析天平（AL204，梅特勒-托利多），超声波清洗器（KQ-250E，昆山超声仪器有限公司），高效液相色谱（型号：e2695；
检测器型号：2998 PDA检测器，美国Waters科技有限公司）。15批怀牛膝经樊锐锋副教授鉴定（黑龙江中医药大学药学院）均为苋科科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，保存于黑龙江中医药大学中药化学实验室（产地见表1），水为超纯水，甲酸、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，β-蜕皮甾酮（纯度≥98%，LOT：HR20625W5）、25R-牛膝甾酮（纯度≥95%，LOT：HR20924W3）、25S-牛膝甾酮（纯度≥98%，LOT：HR4229W4）均采购自宝鸡晨光生物科技有限公司，所购药材晾干，粉碎后过3号筛备用[12]。

表1 15批怀牛膝药材来源

2.1 色谱条件

色 谱 柱 为Waters SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 µm）；
以A：乙腈，B：0.1%甲酸水为流动相；
梯度洗脱条件见表2，检测波长设置为280 nm；
流速为1.0 mL·min-1；
进样10 µL，柱温为25℃，洗脱时间为70 min，理论板数按β-蜕皮甾酮峰计算应不低于4000。

表2 梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液的制备

称取β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮对照品适量，制成浓度分别为2.57、0.55、0.74 mg·mL-1的对照品母液。分别精密量取β-蜕皮甾酮对照品母液800 µL，25S-牛膝甾酮对照品母液500 µL，25R-牛膝甾酮对照品母液500 µL，混合，定容至2 mL，摇匀，得到β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮浓度依次为1.14、0.15、0.21 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取怀牛膝粉末（过三号筛）5 g，置锥形瓶中，加水饱和正丁醇30 mL，密塞，浸泡过夜，超声（功率300 W，频率40 kHz）30 min，滤过，用甲醇10 mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，减压回收至干，以甲醇定容至1 mL，离心取上清液，过0.22 µm滤膜，即得[14]。

2.4 方法学考察

取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液；
2.1项下色谱条件，以β-蜕皮甾酮为参照峰，通过计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积对该方法重复性，仪器精密度以及样品稳定性进行考察。精密称取6份，每份5 g进行重复性考察，取其中一份连续测定6次进行精密度考察，并在室温条件下，分别于0、2、4、8、16、24 h时进行稳定性考察。其共有峰的相对保留时间RSD均〈2.0%，相对峰面积RSD均〈3.0%，说明该方法重复性良好，仪器精密度良好，样品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.5 怀牛膝指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱相似度评价

精密称取15批不同产地的怀牛膝药材粉末各5 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，提取记录各样品色谱图，并将15批样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》中，设S1号样品色谱图为参照图谱，时间窗宽度0.10 min，采用中位数法，多点校正后得到15批怀牛膝药材HPLC图谱叠加图（图1），及对照指纹图谱（R）（图2）。共得到31个共有峰，计算各样品图谱与对照图谱的相似度结果为0.979、0.892、0.896、0.902、0.958、0.978、0.912、0.973、0.977、0.972、0.969、0.876、0.943、0.967、0.802由该相似度分析结果显示，11批样品的相似度大于0.900，其差异性较小，其中产地为河南省安阳市的S2、S3两批药材以及河南省驻马店市的S12、S15两批药材相似度小于0.900，说明不同产地中个别批次的怀牛膝药材成分具有一定的差异性[15-16]。

图1 15批牛膝药材样品指纹图谱

图2 怀牛膝药材对照指纹图谱(R)

2.5.2 共有峰的指认

按2.2项下制备对照品溶液，2.1项下色谱条件对对照品溶液进行测定，将得到的色谱图（图3）与对照指纹图谱进行对比可知，峰13为β-蜕皮甾酮，峰14为25R-牛膝甾酮，峰15为25S-牛膝甾酮。

图3 混合对照品HPLC图

2.6 三种指认成分含量测定

2.6.1 对照品溶液制备

精密称取β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮对照品适量，至5 mL量瓶中，加甲醇定容，得到浓度依次为3.214、0.414、0.630 mg·mL-1的混合对照品溶液。精密吸取对照品溶液适量，加甲醇定容，梯度稀释，共得到混合对照品溶液6份，见表3。

表3 六种梯度混合对照品浓度

2.6.2 线性关系考察

按2.1项下色谱条件对配制的混合对照品溶液进行测定，记录峰面积。以β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮进样量（mg）为横坐标（x），以峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归。其线性回归方程及线性范围见表4。

表4 混合对照品溶液HPLC分析回归方程测定结果

2.6.3 精密度

取2.6.1项下制备的对照品溶液，按2.1项下色谱条件进行连续6次测定，积分获得β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积，在6次测定下，3种成分的峰面积RSD均〈2.0%，说明仪器具有良好的精密度。

2.6.4 重复性

取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末6份，按2.3项下方法制备供试品溶液；
2.1项下色谱条件进行重复性考察。积分获得β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积。其6份样品中3种待测成分的峰面积RSD均〈3.0%，说明该方法的重复性良好。

2.6.5 稳定性

取河南省焦作市的怀牛膝药材粉末6份，按2.3项下方法制备供试品溶液；
2.1项下色谱条件，在室温条件下分别于0、2、4、8、16、24 h时进行稳定性考察，积分获得β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面积。其中3种待测成分的峰面积RSD均〈3.0%，说明该样品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.6.6 加样回收率

精密称取已知含量的怀牛膝药材粉末约1 g，置锥形瓶中，精密加入用水饱和正丁醇配制的混合对照品溶液（β-蜕皮甾酮142 µg·mL-1，25R-牛膝甾酮43 µg·mL-1，25S-牛膝甾酮30 µg·mL-1）5 mL和水饱和正丁醇25 mL，按2.3项下方法制备加样供试溶液，测定并计算β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的加样回收率，测定结果分别见表5，6，7。

表5 β-蜕皮甾酮加样回收率测定结果

表6 25R-牛膝甾酮加样回收率测定结果

表7 25S-牛膝甾酮加样回收率测定结果

2.6.7 样品测定

将15批怀牛膝药材按2.3项处理后进样分析，获得15批怀牛膝药材样品中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的峰面积，利用测得的结果，计算怀牛膝样品中3种甾酮类成分的含量，每组实验平行测定3次，实验结果见表8。

表8 15批怀牛膝药材样品含量测定结果（%，n=3）

2.7 化学计量学分析

2.7.1 聚类热图分析

将15批怀牛膝指纹图谱的31个共有色谱峰的峰面积组成31×15阶矩阵，导入Metabo Analyst 5.0网站中进行聚类热图分析。以共有峰峰面积作为变量，采用标准化中位数法，得到聚类热图，见图4。结果表明，15批怀牛膝样品被分为3类，S1、S2、S3、S4、S5聚为一类，其产地均为河南省安阳市，且其指纹图谱共有峰中2、3、5、10、11、16、24、26、27号峰代表的化学成分明显高于安阳市和焦作市两个产地；
S6、S7、S8、S9、S10聚为一类，其产地均为河南省焦作市，其中共有峰1、4、6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、22、25、28、29、30、31所代表的成分含量略高于安阳市所产怀牛膝，高于驻马店市所产怀牛膝；
S11、S12、S13、S14、S15聚为为一类，其产地均为河南省驻马店市，其中17、19、20、23号峰代表的化学成分明显高于安阳市和驻马店市两个产地。

图4 15批怀牛膝药材样品的聚类热图

2.7.2 主成分分析

将15批怀牛膝指纹图谱的31个共有色谱峰的峰面积组成31×15阶矩阵导入SIMCA 14.1软件，建立PCA模型，采用自标度化法（UV）进行缩放，提取2个主成分，得到模型解释率参数R2X为0.700，预测能力参数Q2为0.544，表明提取的主成分可解释70.0%的原始变量，模型的预测能力为54.4%。15批怀牛膝样品的PCA得分图见图5，结果显示15批怀牛膝样品能基本分为3类，与聚类分析结果相互佐证，进一步说明不同产地怀牛膝化学成分的含量存在一定的差异。

图5 15批怀牛膝药材样品的PCA得分图

2.7.3 偏最小二乘法-判别分析

为进一步寻找不同产地怀牛膝间的差异性成分，我们对15批怀牛膝样品进行PLS-DA分析。将共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件，获得相应PLS-DA模型，提取4个主成分，得到模型解释率参数R2X和R2Y分别为0.838和0.985，模型预测能力参数Q2为0.941，表明模型对变量X的可解释能力为83.8%，对变量Y的可解释能力为98.5%，模型的预测能力为94.1%，说明该模型稳定、可靠。PLS-DA得分图见图6。结果显示15批怀牛膝样品被分为3类，与PCA相比，各组怀牛膝样品进一步聚集。

图6 15批怀牛膝药材样品的PLS-DA图

变量投影重要性（VIP）值是筛选差异化合物的重要指标，VIP值越高，表明其对组间差异的影响越大。以贡献值VIP〉1为标准，得到17个成分，结果见图7。按VIP值大小排序依次为2号峰、24号峰、16号峰、26号峰、5号峰、27号峰、19号峰、3号峰、23号峰、20号峰、17号峰、18号峰、31号峰、29号峰，21号峰、22号峰、28号峰。由此推测这17个共有峰所代表的化学成分可能是导致三个不同产地怀牛膝之间差异的主要变量，与聚类热图分析的差异性成分较为一致[8]。

图7 15批怀牛膝31个共有峰的VIP值

3.1 色谱条件的优化

现阶段对怀牛膝指纹图谱的研究中，共有峰鉴定数量较少，检测时间较长[17]且多需要变波长检测[18]，本实验为了确定最佳色谱条件，对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液3个流动相体系进行了考察，最终确定以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，该条件下系统基线平稳，色谱峰分离较好；
采用2998 PDA检测器对样品进行了190-400 nm全波长扫描，确定检测波长为280 nm，该条件下色谱信息较为丰富，整体峰形较好。通过优化色谱条件，大大缩短了检测时间，同时也确定了最优检测波长，可为不同产地怀牛膝的质量评价的色谱条件提供参考。

3.2 含量测定结果分析

据文献报道[17]，河南省不同地区所产怀牛膝也具有一定质量差异，由含量测定结果可知河南省各产地怀牛膝β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮含量较为接近。2020版《中国药典》中对怀牛膝的质量标准规定以β-蜕皮甾酮含量判断不得少于0.03%，本实验15批怀牛膝的β-蜕皮甾酮含量在0.068%-0.073%之间，明显高于药典标准，而甾酮类成分作为怀牛膝的主要成分之一，具有较好的活性以及可测性，因此本实验通过HPLC指纹图谱建立更加全面的怀牛膝质量评价方法，同时提供了共有性成分25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的含量测定的一种可行性方法。可为怀牛膝的质量评价中甾酮类成分含量测定的指标提供参考依据。

3.3 化学计量学结果分析

为了进一步区分并对不同产地怀牛膝进行质量评价，我们在最佳色谱条件下，建立了15批怀牛膝药材的指纹图谱，其11批相似度在0.900以上，并且标定了31个共有峰，指认了其中3个共有峰成分，其他共有峰成分有待确定。并将15批怀牛膝药材的指纹图谱的共有峰峰面积进行聚类热图分析、主成分分析以及偏最小二乘法—判别分析。结果发现河南省不同产地怀牛膝其他成分存在含量差异，聚类热图分析结果显示15批样品可聚为3类，S1-S5为一类，S6-S10为一类，S11-S15为一类，此与主成分分析结果、正交偏最小二乘-判别分析结果基本一致，通过热图分析可知，安阳所产牛膝中峰2、3、5、10、11、16、24、26、27所代表的化合物含量较高，驻马店市所产牛膝中峰17、19、20、23所代表的化合物含量较其他产地高，焦作市所产牛膝中以上成分含量均小于其他两个产地，通过对比以上共有峰可初步筛选区分该牛膝所属产地，依据VIP〉1得到的17个共有峰，推测该17个成分可能为造成不同产地怀牛膝质量差异的潜在成分，可对不同产地的怀牛膝质量控制中其他指标的选择提供实验参考。

本研究建立了一种简单、快速、便捷且具有较好的准确性的怀牛膝三种甾酮类成分（β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮）的含量测定方法，同时建立了15批怀牛膝的指纹图谱，并首次结合化学计量学从多角度相互验证下对不同产地15批怀牛膝的共有成分进行分析，筛选出了不同产地间怀牛膝质量差异性成分，可为怀牛膝的质量控制提供参考。