儿童急性淋巴细胞白血病中E-钙黏蛋白甲基化对预后的影响

齐凤旗 韩伟 颜静 辛聪 李艳 郭雷 王文鹏 高吉照

（徐州医科大学附属医院儿科血液与肿瘤病区，江苏徐州 221002）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈逐步上升趋势[1]。ALL的发生是多基因、多阶段变异累积形成的病理过程，抑癌基因功能失活是关键机制之一[2]；
细胞间黏附分子的丢失和/或功能缺失则导致肿瘤转移[3]。抑癌基因和细胞间黏附分子功能可通过多种途径失活，如基因突变、丢失及DNA甲基化修饰等[2-3]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是一种钙依赖性细胞间黏附分子和肿瘤抑制蛋白，与多种恶性肿瘤如乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌等的发生发展密切相关[4-6]，E-cadherin基因在儿童ALL中存在高度甲基化[7]，但其甲基化状态对儿童ALL预后的影响未见报道。本研究旨在探讨E-cadherin表达及其基因甲基化状态对儿童ALL预后的影响。

1.1 研究对象

选取徐州医科大学附属医院儿科血液与肿瘤病区2018年5月—2022年1月首次确诊的ALL患儿作为研究对象。纳入标准：（1）根据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[8]的ALL诊断、治疗和疗效评判标准首次确诊的ALL，年龄0～16岁；
（2）第33天患儿骨髓均达完全缓解；
（3）正规治疗至随访结束者。排除标准：（1）伴有其他恶性疾病及自身免疫病；
（2）确诊前使用激素及其他免疫抑制剂；
（3）至随访终止前放弃治疗、转外院及失访者；
（4）不同意入组者。入组患儿根据确诊时及诱导化疗第33天分为治疗前组和治疗后组。本研究获徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，批准号：XYFY2022-KL089。

1.2 治疗方案

采用《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[8]方案即中国儿童白血病协作组（Chinese Children"s Leukemia Group，CCLG） 急性淋巴细胞白血病2008（CCLG-ALL-2008）方案化疗，VDLP方案诱导缓解治疗：V为长春地辛；
D为柔红霉素；
L为培门冬酶替代左旋门冬酰胺酶；
P-地塞米松代替醋酸泼尼松。

1.3 主要试剂与仪器

淋巴细胞分离液（MP Biomedicals公司，美国），红细胞裂解液（上海碧云天生物科技有限公司，中国）TRIzol（Invitrogen公司，美国），cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green、18-T Vector（TaKaRa公司，日本），亚硫酸氢盐处理试剂盒（Promega公司，美国），PCR引物、BCA蛋白含量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Rabbit Anti-GAPDH、Rabbit Anti-E-cadherin、羊抗兔IgGHRP、全蛋白提取试剂盒、Western Blotting检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，中国），PCR纯化试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，中国]。普通梯度PCR仪、荧光定量PCR循环仪（ABI公司，美国），移液器（Eppendorf公司，德国），电泳仪、Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统、凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国）。

1.4 标本制备

采集化疗前及诱导化疗第33天患儿骨髓血5 mL，EDTA抗凝，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，PBS液洗涤3次，将单个核细胞移至EP管，-80℃冰箱冻存。

1.5 RT-qPCR检测E-cadherin mRNA的表达

按照TRIzol说明书提取单个核细胞总RNA；
参照cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA；
E-cadherin上游引物：5"-TACCCTGGTGGTTCAAGCTG-3"，下游引物5"-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3"，片段长度128 bp，GAPDH上游引物 5"-AGATCATCAGCAATGCCTCCT-3"，下游引物5"-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3"，片段长度90 bp，将2×Realtime PCR Master Mix （SYBR Green） 10 μL、1 μL 模板 （cDNA 稀释 10倍）、2 μL 引物 （上 下游引物各为 10 μmol/L）、7 μL 0.1%DEPC水和20 μL Total volume依次加入0.1 ml PCR管，95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共40个循环；
95℃变性15 s，骤冷至60℃。制作溶解曲线，采用相对定量法（2-△△C）t对结果进行比较分析。

1.6 Western blot检测E-cadherin 蛋白表达

PBS液洗涤2次骨髓单个核细胞，加入Lysis Buffer裂解液，冰上裂解20 min，4℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清，取200 μg行10%SDS-PAGE电泳，电泳条件：电压60 V，蛋白进入分离胶后，提高到90 V；
转膜，TBST洗膜5 min×3次；
置入含一抗（1∶10 000稀释）平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜，次日室温振荡30 min，弃一抗，TBST洗膜10 min×3次，加二抗（1∶10 000稀释），室温摇床振荡反应2 h，弃二抗，TBST洗膜5 min×3次。ChemiDoc MP Imaging System成像，Gel-Pro32软件灰度分析，蛋白相对表达量采取灰度值/内参获得。

1.7 甲基化特异性PCR法检测E-cadherin基因甲基化

按照DNA提取试剂盒提取DNA；
纯化，乙醇沉淀和重悬。PCR扩增体系30 μL：上下游引物（10 μmol/L） 各 1 μL，DNA 2 μL， dNTP 1 μL，10×PCR reaction buffer 3 μL， Taq 酶 1 μL， H2O 21 μL。E-cadherin基因甲基化特异性上游引物5"-GGGTTATCGCGTTTATGC-3"，下游引物5"-CCCCGTACCGCTAATTAAC-3"，扩增产物 120 bp；
非甲基化特异性上游引物5"-AGAGGGTTATTGTGTTTATGT-3"，下游引物5"-CCCCCCATACCACTAATTAACT-3"，扩增产物120 bp。扩增条件：95℃预变性10 min；
94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环40次；
72℃延伸5 min；
1%琼脂糖凝胶电泳。电泳条件：电压100 V，时间25 min；
凝胶成像系统拍照保存。甲基化判定：甲基化特异性引物扩增阳性，即为甲基化阳性；
若甲基化特异性引物扩增阴性，需非甲基化特异性引物同时扩增阳性才可判断为甲基化阴性。

1.8 随访

入组患儿随访至2022年6月30日，随访内容：微小残留、骨髓细胞形态学、初诊时异常分子/遗传学结果、骨髓/髓外复发及处理、死亡。

1.9 统计学分析

使用IBM SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计学分析。计量资料呈正态分布以均数±标准差（±s）表示，治疗前与治疗后比较采用配对t检验；
计数资料比较使用χ2检验；
生存分析采用Kaplan-Meier法，组间总生存（overall survival，OS）率和无事件生存（event-free survival，EFS）率比较采用log-rank检验。以α=0.05为检验水准。

2.1 一般资料

共纳入ALL患儿42例，其中男性23例，女性19例，年龄8.6个月至13岁，中位年龄5.54岁。42例患儿中骨髓幼稚细胞最高95%，最低31%，平均76%，B原始淋巴细胞的白血病38例（90%），T淋巴细胞白血病4例（10%），染色体核型异常14例（33%），正常25例（60%），未见分裂相3例（7%），融合基因阳性24例（57%），基因突变10例（24%）。

2.2 两组E-cadherin mRNA和蛋白的表达

治疗后组E-cadherin mRNA和蛋白的相对表达高于治疗前组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 两组E-cadherin mRNA和蛋白的相对表达 （±s）

表1 两组E-cadherin mRNA和蛋白的相对表达 （±s）

图1 治疗前和治疗后组E-cadherin蛋白表达电泳1～3为治疗前组；
4～6为治疗后组。

2.3 两组E-cadherin 基因甲基化状态

治疗后13例E-cadherin基因甲基化阳性患儿转阴，治疗后组E-cadherin基因甲基化状态阳性率较治疗前组下降，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图2。

表2 两组E-cadherin基因甲基化阳性率

图2 治疗前和治疗后组E-cadherin 基因甲基化图1～2为治疗前组；
3～4为治疗后组；
M示甲基化阳性，U示甲基化阴性。

2.4 随访结果

随访至2022年6月30日或死亡发生时间。42例患儿中复发3例，其中2例为骨髓复发，1例为髓外复发（中枢神经系统白血病）；
死亡4例，均为甲基化阳性者。甲基化阴性者OS率和EFS率均高于甲基化阳性者，差异有统计学意义（χ2=3.927，P=0.0475；
χ2=4.013，P=0.045），见图3～4。

图3 甲基化阴性者总体生存率高于甲基化阳性者

图4 甲基化阴性者无事件生存率高于甲基化阳性者

E-cadherin是胞外域、跨膜域和胞内域构成的跨膜糖蛋白，由CDH1基因编码，是钙黏蛋白家族中的一员，属于Ⅰ类经典钙黏蛋白[9]。E-cadherin与β-catenin形成复合物，锚定于肌动蛋白细胞骨架上，使细胞稳定连接[3]，维持细胞黏附和上皮结构完整，成为调节上皮-间充质的关键标志物[10]。在结直肠癌、胃癌、甲状腺癌、乳腺癌等疾病中E-cadherin可通过影响上皮间充质的转化发挥抑制肿瘤细胞的作用[4-6，11]，且与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、囊外浸润等相关[10]。本研究显示，治疗后E-cadherin mRNA和蛋白表达水平高于治疗前，我们考虑化疗可抑制E-cadherin基因甲基化，使其正常表达，抑制白血病细胞的迁移和浸润。本试验前期研究已验证E-cadherin的表达与外周血白细胞计数的多少、骨髓及外周血原幼稚细胞比例无明显相关性[12]，不排除分子生物学方面影响E-cadherin的表达，影响儿童ALL的预后。同时，E-cadherin的低表达使E-cadherin/β-catenin复合物减少，大量β-catenin积累在细胞质并进入细胞核，激活信号通路[13-14]，参与儿童ALL的发展。

DNA甲基化是影响基因转录和表达的主要表观遗传修饰，肿瘤抑制基因启动子和增强子区域中胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytidine phosphate guanosine，CpG）的高甲基化是肿瘤发生、癌细胞存活及侵袭性增强的重要机制[15]。一些癌相关基因启动子的甲基化与基因失活有关如E-cadherin、P16等，是许多肿瘤发生早期事件的关键因素[16]。DNA甲基化可致基因突变、染色体异常等，影响肿瘤进展和预后[17]。本实验发现诱导治疗后13例E-cadherin基因甲基化阳性患儿转阴，我们认为诱导化疗后达到完全缓解，一方面白血病细胞被大量杀灭，高甲基化细胞大量减少；
另一方面，不排除诱导方案中有能使E-cadherin基因去甲基化的药物。有研究[18]报道柔红霉素联合地西他滨比单用地西他滨使DNA去甲基化效果好，故诱导治疗后，部分患儿E-cadherin基因甲基化由阳性转为阴性。

生存分析显示E-cadherin基因甲基化阴性患儿OS率和EFS率高于甲基化阳性患儿，DNA甲基化导致E-cadherin沉默，功能丧失，使白血病细胞增殖、增加侵袭力[19]，致使化疗效果不理想导致复发甚至死亡。因此我们认为，E-cadherin基因甲基化状态是影响儿童ALL治疗效果及预后的因素之一。治疗前或对治疗效果不佳的患儿，检测其E-cadherin基因甲基化状态或水平，对预测ALL患儿预后有一定意义。如果能找到理想的甲基化抑制剂，可能会使存在E-cadherin基因甲基化的患儿获益。