CREB激活促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录的实验研究

王 蓉，万 琪，谢 晔，徐 陶，曾俊伟，刘晓红

(遵义医科大学 生理学教研室，贵州 遵义 563099)

脊髓背角可以接受来自外周的伤害性信息并将其传至大脑高级中枢，而脑内的下行抑制/易化系统也可对伤害性信息进行调制[1]。近年研究表明，超极化激活的环核苷酸门控(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gating，HCN)通道有4个成员，分别为HCN1-4，在神经病理性疼痛的发生与维持中发挥重要作用[1-2]。在脊髓背角，HCN4表达于GABA能抑制性中间神经元和蛋白激酶Cγ(Protein kinase Cγ，PKCγ)阳性兴奋性中间神经元[3-7]。鞘内给予HCN通道阻滞剂ZD7288明显减轻慢性坐骨神经缩窄性损伤(Chronic constriction injury， CCI)或糖尿病大鼠的热痛及机械痛症状，并显著抑制其脊髓背角HCN4表达上升[3-6]。而且，鞘内注射HCN4慢病毒颗粒导致背角HCN4表达下调，明显缓解化疗大鼠的机械痛敏，其机制与抑制背角γ-氨基丁酸B型受体(Gamma-amino butyric acid receptor，GABABR)表达有关[8]。因此，探讨HCN4通道的表达调控机制有助于以HCN4通道作为靶点进行镇痛药物研发。

环磷酸腺苷-蛋白激酶A (Cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA)信号通路在HCN4通道的活性调节中具有重要作用。环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)与HCN4通道蛋白的cAMP结合域结合，随后HCN4通道开放,形成的净内向电流使细胞兴奋性增强[9]。PKA 抑制剂可抑制大鼠背根节以及前额叶皮层神经元 HCN 通道电流，导致神经元兴奋性降低[10-11]。在坐骨神经损伤大鼠中，脊髓背角cAMP-PKA信号通路的激活促进钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)活化和转录因子cAMP反应元件结合蛋白(Cyclic-AMP response binding protein，CREB)磷酸化，引起下游疼痛相关基因转录[12-14]。然而，目前并不清楚信号分子PKA、CaMKII和CREB的激活是否促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录和表达。CREB作为转录因子，是否能够结合到HCN4启动子序列并促进其转录和表达，尚需实验证实。因此，本实验制备CCI神经痛模型，鞘内分别给予H-89(PKA抑制剂)，KN-93(CaMKⅡ抑制剂)或Naphthol AS-E(CREB抑制剂)，观察这些工具药对神经痛大鼠的机械痛行为的影响，分析PKA、CaMKII和CREB的激活对脊髓背角HCN4转录及蛋白表达的影响。

1.1 试剂 H-89(PKA抑制剂，B1427)、KN-93(CaMKⅡ抑制剂，K1385)来自美国Sigma；
Naphthol AS-E(CREB抑制剂，HY-104068)来自MCE；
兔抗 HCN4 多克隆抗体(55224-1-AP)、兔抗 CREB多克隆抗体(12208-1-AP)、兔抗β-actin 多克隆抗体(20536-1-AP)、小鼠抗β-actin单克隆抗体(66009-1-Ig)均来自美国 Proteintech；
兔抗p-CaMKⅡ(Ser286)单克隆抗体(12716S)、兔抗 p-CREB(Ser133)单克隆抗体(9198S)来自美国 Cell Signaling Technology；
兔抗GAPDH单克隆抗体(ET1601-4)来自华安生物；
小鼠抗PKA单克隆抗体(sc-365615)、小鼠抗 CaMKⅡ 单克隆抗体(sc-5306)来自Santa Cruz；
兔抗 p-PKA单克隆抗体(ab75991)来自 Abcam；
CREB探针及引物来自上海生工有限公司；
核蛋白提取试剂盒(NT-032)来自Invent公司；
Triozl试剂(9108)、逆转录试剂盒(RR037A)和SYBR Green荧光染料试剂盒(RR820A)来自TaKaRa；
EMSA试剂盒(GS009)来自上海碧云天生物科技公司。

1.2 主要仪器 电子Von Frey测痛仪购自美国IITC Life Science；
电泳仪和电泳槽和半干电转移系统购自美国 Bio-Rad Laboratories；
全能型凝胶成像系统购自英国 Syngene；
Quant Studio TM 6 Flex PCR仪购自美国Thermo Fisher scientific。

1.3 实验动物分组 体重200～230 g雄性SD大鼠购自长沙天勤公司[许可证号SCXK(湘)2019-0014]；
实验期间大鼠分笼，于温度(22±2)℃、湿度50%左右、昼夜交替12 h环境中饲养。分为6 组：(1) Sham组；
(2) Sham+Vehicle组；
(3) CCI+Vehicle组；
(4)CCI+H-89(8nM)；
(5)CCI+KN-93(50nM)；
(6)CCI+Naphthol AS-E(5 μg/10uL)。Sham组大鼠仅暴露坐骨神经不结扎。其余各组大鼠在鞘内置管7 d后建立CCI模型,术后分别鞘内注射0.005 % DMSO生理盐水、H-89、KN-93 或Naphthol AS-E。10 μL/次，连续7 d，每天1次。

1.4 建模

1.4.1 鞘内置管 戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，取俯卧位固定，在L3～L4间隙纵向切开背部皮肤，分离L4棘突两侧肌肉，剪掉L4棘突及相邻的白色椎板，使L3与L4棘突间隙得以暴露出来，用弯针挑破黄韧带及硬脑膜，当看到脑脊液溢出时，在此处插入PE-10导管，然后轻轻向上推2 cm，到达腰膨大处，随后将导管尖端固定在大鼠颈部区域。术后注射青霉素预防感染。术后第2天通过导管注射2%利多卡因(15 μL)，若注射后30 s内出现双侧下肢瘫软，则为置管成功。只有无明显神经症状的正常大鼠被纳入实验。

1.4.2 CCI模型 大鼠置管成功7 d后，戊巴比妥钠(40 mg/kg，i.p.)麻醉并固定，在股骨外侧上方纵向切开长约1.5 cm的切口，钝性分离肌肉，使坐骨神经完全暴露，用4.0非吸收性医用缝合线结扎坐骨神经4道，每道间距大约为1 mm。结扎强度一般以引起小腿肌肉轻微颤动为宜。术后分笼饲养并注意清洁以防感染。Sham组大鼠仅暴露坐骨神经不结扎。

1.5 行为学测定 利用电子足底触觉测定仪来检测大鼠的MWT。在相对安静的环境中，将上述各组大鼠分别单独放置于金属丝网眼的透明玻璃笼中，待大鼠适应环境15～20 min后，将刚性尖端垂直地刺向大鼠后爪足底皮肤，在此过程中，若大鼠出现轻微的肌肉收缩或后爪抬起的反应，则判断为阳性反应，此时可记录下仪器上显示的缩爪阈值，切断值设置为60 g。每5分钟检测1次，重复进行3次，取平均值。所有大鼠均在CCI手术前1 d，术后1、3、5、7 d测定。

1.6 WB检测脊髓背角HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表达 CCI术后7 d，戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，取术侧的背侧脊髓约7 mm(L4～ L6)，置于EP管中，加入200 μL RIPA裂解混合液(RIPA：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=100∶1∶1)后，用高通量组织研磨仪研磨混合后置于冰上，裂解30 min，每隔10 min震荡一次；
4 ℃，12 000 rpm离心20 min，取上清液，用BCA法检测总蛋白浓度，其余上清液加入上缓变性。每孔加80 μg蛋白，SDS-PAGE电泳，膜转移，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入兔源HCN4抗体(1∶500)，小鼠源 PKA抗体(1∶100)，兔源p-PKA抗体(1∶1 000)，小鼠源CaMKⅡ抗体(1∶100)，兔源p-CaMKⅡ抗体(1∶1 000)，兔源CREB抗体(1∶500)，兔源p-CREB抗体(1∶1 000)，兔源GAPDH抗体(1∶50 000)，兔源β-actin抗体(1∶3 000)，小鼠源β-actin抗体(1∶5 000)，4℃过夜后。将膜放在TBST中清洗3次，每次间隔10 min，随后加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶3 000)或羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，再次洗膜30 min，清洗完毕的PVDF膜采用化学发光法进行检测，将显影液混匀后滴在膜上，并放入仪器内曝光显色。数据采取ImageJ 1.48软件处理，GAPDH或β-actin为内参，以相对蛋白表达水平进行统计分析[(实验组目的蛋白灰度值/实验组内参灰度值) / (Sham组目的蛋白灰度值/Sham组内参灰度值)]。

1.7 RT-qPCR检测HCN4 mRNA表达 CCI术后7 d，用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，取术侧的背侧脊髓约7 mm(L4～ L6)，置于无酶的EP管中，Trizol 法抽提组织总 mRNA。纯化后，使用无酶水洗脱RNA，并测定其浓度和纯度。260∶280的吸光度比应在1.9～2.1的范围内。使用逆转录试剂盒和荧光染料试剂盒进行逆转录和扩增反应。根据GenBank上搜索的序列设计引物。本研究中使用的引物的核苷酸序列如下：(1) HCN4 (genebank:NM_021658.2):F:5′-CACTAAGGGCAACAAGGAGACCAAG-3′；
R:5′-TGAGTAGAGGCGGCAGTAAGTATCC-3′，(2)β-actin(genebank:NM_007393.5):F:5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；

R:5′-CCAGTTG GTAACAATGCCATGT-3′。qPCR的体系为20 μL，其中7 μL DEPC水、10 μL TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ、0.5μL PCR Forward Primer (10μM)、0.5μL PCR Reverse Primer(10 μM)和2 μL cDNA。每个孔均要做复孔。逆转录反应条件为：37 ℃，15 min，85℃，5 s；
扩增反应条件为：95 ℃，30 s；
95 ℃，5 s；
60 ℃，30 s；
40 个循环。以β-actin为内参对照，统计各组CT值，采用2-△△CT(Livak法)法进行数据分析。

1.8 电泳迁移率实验(EMSA)检测CREB与HCN4启动子区域的DNA结合活性 CCI术后7 d，用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，取术侧的背侧脊髓约7 mm(L4～ L6)，置于EP管中，根据胞核提取试剂盒说明书步骤提取核蛋白，BCA法测定核蛋白浓度，-80℃保存。在PROMO和JASPAR数据库预测到转录因子CREB可能与HCN4启动子区域的四段序列结合。因此，由上海生工有限公司合成生物素3′端DNA标记的CREB探针，分别为CREB-1 (234-255bp):5′-GCTCCAGGTGATGTCATCACCC-3′；
CREB-2(838-859bp):5′-CAGAGTATCAGGTCACCAGAGG-3′；
CREB-3(1409-1430bp):5′-GGAGTAAGGACGCCTCCTACCT-3′；
CREB-4(1668-1689bp):5′-CGGCGGCTGATGTAAGCCCGGC-3′，将探针退火为双链。使用EMSA化学发光试剂盒检测CREB与HCN4启动子之间的结合活性。核蛋白-DNA探针反应总体积为10 μL：核蛋白5 μg，2μL 5×Binding buffer，室温反应10 min后，加入生物素标记探针1 μL，反应20 min，剩余用无酶水补足10 μL；
随后加入1 μL 10×Loading buffer。对于竞争实验：体系中添加100倍量的未标记的CREB探针，室温孵育20 min后加入标记探针，其余步骤一致。然后将反应物在5%凝胶上进行电泳，随后转移到带正电荷的尼龙膜上，其余步骤参照EMSA试剂盒说明书。

2.1 鞘内注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E 抑制剂对CCI大鼠机械痛阈的影响 在坐骨神经结扎前1 d，结扎后 1、3、5、7 d内，检测各组大鼠机械痛阈变化。结果显示(见图1)，Sham 组和Sham+Vehicle组的MWT 始终稳定于基础水平，差异无统计学意义。与Sham组相比，CCI+Vehicle组在第1、3、5、7天的MWT明显降低，具有统计学意义(P<0.05)。与CCI+Vehicle组相比，鞘内注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的药物治疗组MWT显著升高(P<0.05)。

2.2 鞘内注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E对CCI大鼠脊髓背角HCN4表达的影响 如图2A，Sham组和Sham+Vehicle组背角HCN4 mRNA的表达无统计学意义。与Sham组相比，CCI+Vehicle组脊髓背角HCN4 mRNA表达显著升高，具有统计学意义(P<0.05)。与CCI模型组相比，鞘内注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的药物治疗组背角HCN4 mRNA表达显著下降，具有统计学意义(P<0.05)。如图2B所示，Sham 组和Sham+Vehicle组背角HCN4在蛋白表达水平无统计学意义。与Sham组相比，CCI+Vehicle组HCN4 蛋白表达显著升高，具有统计学意义(P<0.05)。与CCI+Vehicle组相比，鞘内注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的药物治疗组背角HCN4 蛋白表达显著下降，具有统计学意义(P<0.05)，说明HCN4表达受PKA、CaMKII和CREB调控。

*:与Sham组比较,P<0.05；
+:与CCI+Vehicle组比较,P<0.05,n=8。图1 各组大鼠的机械痛敏变化情况

2.3 鞘内注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E对CCI大鼠脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表达的影响 如图3，Sham组和Sham+Vehicle组脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB的表达无统计学意义。与Sham组相比， CCI+Vehicle组PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB表达显著增加，具有统计学意义(P<0.05)。与CCI+Vehicle组相比，鞘内注射H-89、KN-93或Naphthol AS-E的药物治疗组背角PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB表达显著下降，具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 鞘内注射H-89、KN-93或 Naphthol AS-E对CREB与HCN4启动子区域结合活性的影响 如图4，探针CREB-1(含有CREB激活位点元件的生物素3’端DNA标记探针)与来自CCI+Vehicle组的大鼠背角核蛋白提取物混合，进行凝胶电泳。与Sham组相比，来自CCI+Vehicle组的核提取物有效地结合大量CREB-1探针，显示浓重的迁移条带，然而，H-89、KN-93或Naphthol AS-E药物治疗组CREB迁移条带减少。CCI+Vehicle组的核提取物添加过量的未标记探针后无法检测到CREB结合条带。同时，尽管反复变换试验条件，但均未观察到其他探针(CREB-2、CREB-3、CREB-4)与来自CCI组的核提取物形成的凝胶条带，这初步证实CREB可以识别并结合到HCN4启动子区域242-249bp的序列(5′-GCTCAGGTGAGTGCCCC-3′)，参与HCN4基因转录。

*:与Sham组比较,P<0.05；
+:与CCI+Vehicle组比较,P<0.05,n= 4～6。图2 各组大鼠脊髓背角HCN4的表达

*:与Sham组比较,P<0.05；
+:与CCI+Vehicle组比较,P<0.05,n=4。图3 各组大鼠脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB的表达

CREB：探针与DNA-转录因子结合条带；
NS：non-specific band，非特异条带；
NP：no protein，未加入蛋白提取物；

UP:unlabeled probe，无标记探针。图4 CREB 与HCN4启动子区域DNA结合活性

在脊髓背角，HCN4通道表达于抑制性中间神经元和PKCγ+兴奋性中间神经元，参与神经痛的形成与维持。在本试验中，鞘内注射PKA 抑制剂H-89、CaMKⅡ抑制剂KN-93或CREB抑制剂Naphthol AS-E均可以减轻大鼠坐骨神经结扎导致的机械痛敏，同时抑制脊髓背角HCN4在mRNA和蛋白水平的表达，提示HCN4的表达受PKA、CaMKⅡ及转录因子CREB的调控。

cAMP 是一种细胞内的第二信使物质，胞内 cAMP 浓度升高和随后的PKA激活均有助于背根神经节神经元 HCN 通道开放并形成净内向电流，感觉神经元兴奋性增加，引起痛觉敏化[15]。目前已发现的4种HCN 通道(HCN1-4)中，对 cAMP的反应敏感性依次为：HCN4>HCN2>HCN3>HCN1[4,16]。本试验中，鞘内注射PKA 抑制剂H-89导致CCI大鼠脊髓背角PKA表达下降，磷酸化减弱，同时也下调HCN4在mRNA和蛋白水平的表达。可见，PKA激活不仅有助于HCN4通道开放，也有助于其转录表达。

在神经痛的发生和维持过程中，背角cAMP/PKA通路的激活促进CaMKII活化和其下游转录因子CREB磷酸化，特别是CREB的Ser-133位点磷酸化直接受PKA和CaMKII的调控[12-13,17]。

本试验分别鞘内注射KN-93或Naphthol AS-E，随后CCI大鼠脊髓背角CaMKII和CREB的表达及磷酸化程度均减弱，HCN4在mRNA和蛋白水平的表达明显下降。更重要的是，鞘内注射PKA抑制剂H-89导致CCI大鼠背角CaMKII和CREB的表达及磷酸化程度均减弱，这说明PKA的激活有助于CaMKII和CREB的表达及磷酸化，而CaMKII和CREB的激活对于HCN4的转录和蛋白表达也非常重要。

CREB是一种重要的转录因子，其C端的亮氨酸拉链结构既可以与靶基因的经典cAMP反应元件(cAMP response element，CRE，含5"-TGACGTCA-3′回文序列) 结合，或与CRE变体序列5′-TGATGTCA-3′结合，也可以与非经典CRE序列(如5′-AGGCGTGG-3′或5′-AGGATGCG-3′等)结合并启动靶基因转录[18]。Smith等[19]针对哺乳动物(如人、大鼠、小鼠以及狗)的基因组序列进行研究，观察到5′-TGATGTCA-3′是最常见的CRE变体序列。本试验检测到CREB可以识别并结合到HCN4启动子区域242-249bp序列(5′-TGATGTCA-3′，为哺乳动物体内最常见的CRE变体序列)，促进HCN4基因转录。在HCN4启动子序列中并没有检测到经典cAMP反应元件的存在。因此，初步推测，在CCI大鼠脊髓背角HCN4的转录增加，是由于转录因子CREB磷酸化之后，进入细胞核，结合到HCN4启动子的CRE变体序列(5′-TGATGTCA-3′)，促进HCN4的转录和随后的蛋白表达。鞘内注射H-89或KN-93明显下调神经痛大鼠脊髓背角CREB与HCN4启动子之间的结合活性，说明CREB与HCN4启动子之间的结合受到PKA和CaMKII的调控。

在脊髓背角神经元，主要表达两种腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase，AC)，即ACⅠ 和ACⅧ。当胞质中Ca2+浓度上升时，与钙调蛋白结合为Ca2+/钙调蛋白复合物，迅速激活ACⅠ和ACⅧ[20]；
其中，磷酸化的CREB既可以与ACⅧ启动子区域的CRE位点结合，促进ACⅧ 的转录生成[21]，也可以与NMDA受体的NR1和NR2亚单位启动子结合促进其转录生成[22]。本试验中，鞘内注射CREB抑制剂NaphtholAS-E明显抑制CCI大鼠脊髓背角PKA和CaMKII的表达及磷酸化。这可能有两个原因：CREB表达及磷酸化程度下降，一方面导致ACⅧ生成减少，不能促进cAMP生成和PKA磷酸化，另一方面导致NMDA受体表达和激活减弱，神经元Ca2+内流减弱，Ca2+/钙调蛋白复合物生成减少，无法充分激活ACⅠ和ACⅧ，导致cAMP生成和PKA磷酸化减弱，CaMKII的表达及磷酸化也相应减弱。此外，本试验中，鞘内注射CaMKII抑制剂KN-93可以通过抑制CREB的表达及活性，间接导致CCI大鼠脊髓背角PKA表达及磷酸化减弱。

综上所述，在坐骨神经损伤的神经痛大鼠，脊髓背角PKA、CaMKII和CREB的表达及磷酸化程度增强，其中，PKA和CaMKII的激活明显促进转录因子CREB活化，导致CREB与HCN4启动子序列上的CRE变体序列(5′-TGATGTCA-3′)结合，这促进了HCN4在mRNA和蛋白水平的表达。有关HCN4的表达调控机制的探讨有助于研发以HCN4作为靶点的新型镇痛药物，将来应用于临床，通过抑制HCN4表达，间接下调感觉神经元兴奋性，从而发挥镇痛效应。