维氏气单胞菌CA07株灭活疫苗生产工艺的优化

孙承文，巩华，2，赖迎迢，2，江小燕，任燕，2，陈总会，黄志斌，2，陶家发，2

1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380；
2.农业部渔药创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii，AV）属于弧菌科（Vibronaceae）气单胞菌属（Aeromonas），广泛分布于水体环境中，是一种新型人⁃兽⁃鱼共感染的致病菌，该菌可感染多种鱼类，发病鱼类表现为腹水及鳍条基部、眼眶、体表部位充血等症状，该病流行区域广泛，危害严重，给水产养殖业造成了严重的经济损失［1⁃7］。目前，对该菌感染的防控还是以见效快、疗效好的抗菌素类药物为主，但随着抗菌素的大量使用，AV 的耐药性特别是多重耐药性日益严重，出现了大量耐药菌株［8］，因此开发AV相关疫苗对预防该病具有重要意义。

目前，已有多家科研单位研发了AV 灭活疫苗，且具有良好的免疫效果［9⁃10］，但尚未见该疫苗的产业化生产研究及应用的相关报道。因此，本研究对AV CA07株灭活疫苗规模化生产工艺进行优化，以期制备高质量的AV灭活疫苗，为其产业化生产奠定基础。

1.1 菌株 AV CA07 株由中国水产科学研究院珠江市场研究所分离鉴定及保存。

1.2 实验动物 健康鲫鱼购自佛山市三水白金水产种苗有限公司，体质量为12~16 g。

1.3 主要试剂及仪器 胰蛋白胨及牛肉膏购自广东环凯生物科技有限公司；
葡萄糖、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾及甲醛溶液购自广州化学试剂厂；
50 L 种子罐及500 L 发酵罐购自福州福尔流体设备有限公司；
7 L自动发酵罐购自广东齐志生物科技有限公司；
紫外分光光度计购自上海奥析生物科技有限公司。

1.4 培养基的配制 优化发酵培养基：胰蛋白胨10.0 g／L、牛肉膏5.0 g／L、葡萄糖5.0 g／L、硫酸镁0.4 g／L、磷酸二氢钾2.0 g／L 及氯化钠5.0 g／L；
LB 培养基：酵母提取物 5 g／L、蛋白胨 10 g／L 及NaCl 5 g／L；
NB培养基：蛋白胨1.0 g／L、牛肉浸出粉5.0 g／L、酵母浸出粉2.0 g／L及氯化钠5.0 g／L；
营养琼脂培养基：18 g／L琼脂粉。均经121 ℃高压灭菌。

1.5 AV CA07株灭活疫苗生产工艺的优化

1.5.1 种子液培养时间的确定 取冻存AV CA07 株菌种，加入少许NB 培养基溶解，将100 μL 菌液接种于营养琼脂培养基，28 ℃培养24 h；
挑选单菌落，接种于营养琼脂培养基，继续培养24 h；
挑取菌落，接种至 NB 培养基，28 ℃，150 r／min 振荡培养制备种子液，每2 h 取样1 次，至A600不再升高，以培养时间为横坐标，A600为纵坐标，绘制生长曲线，每个时间点重复检测3 次。以A600最高时的时间为最佳培养时间，并于该时间进行活菌计数。

1.5.2 发酵培养基的确定 用7 L 发酵罐分别配制不同培养基（优化发酵培养基、LB 培养基、NB 培养基），将AV CA07株种子液分别按1%的接种量接种，于28 ℃，通气量2 L／min，200 r／min振动培养12 h；
收获菌液，进行活菌计数。

1.5.3 发酵条件的确定

1.5.3.1 接种量 选用1.5.2 项确定的最佳培养基，按不同接种量（1%、5%、10%、15%）接种AV CA07 株种子液，于28 ℃，通气量4 L／min 条件下培养12 h，收获菌液，进行活菌计数。

1.5.3.2 通气量 选用1.5.2 项确定的最佳培养基，按5%的接种量接种AV CA07株种子液，通气量分别设为2、4、6、8 L／min，于28 ℃发酵培养12 h，收获菌液，进行活菌计数。

1.5.3.3 发酵时间 选用1. 5. 2 项确定的最佳培养基，按5%的接种量接种AV CA07株种子液，于28 ℃，通气量4 L／min 条件下分别发酵6、8、10、12 h，收获菌液，进行活菌计数。

1.5.4 灭活条件的确定 选用1. 5. 2 项确定的最佳培养基，按5%的接种量接种AV CA07 株种子液，于28 ℃，通气量6 L／min条件下发酵培养12 h，收集菌液，分装三角瓶，200 mL／瓶。依次加入甲醛溶液至终浓度为0.10%、0.20%、0.30%、0.40%，分别于28和37 ℃，80 r／min摇床灭活24、48、72 h，取菌液1 mL，接种营养琼脂培养基，检测灭活效果。每种条件下的样品重复检测3次。

1.6 AV CA07株灭活疫苗规模化生产工艺的建立 配制300 L优化发酵培养基，分别加入50 L种子罐（30 L）和500 L发酵罐（270 L），按培养基体积的0.02%加入消泡剂，121 ℃高压灭菌20 min，待培养基温度降至约28 ℃，以5%接种量将种子液接种于50 L 种子罐，罐压0.05 MPa，通气量40 L／min，转速200 r／min ，28 ℃培养12 h；
将50 L 种子罐培养液接种至500 L 发酵罐，罐压0.05 MPa，通气量180 L／min，转速200 r／min，28 ℃培养12 h。均每 2 h 取样1 次，检测A600；
于培养12 h 时进行活菌计数。发酵菌液转入灭活罐，加入甲醛溶液终浓度为0.30%，37 ℃，80 r／min 搅拌灭活24 h，取菌液1 mL，接种于营养琼脂培养基，检测灭活效果。共制备3批。

1.7 安全性试验 取健康鲫鱼120 尾，置27 ~ 29 ℃温度的水环境中适应饲养7 d 以上，确认健活后，将鱼随机分为4组，每组30尾。3个疫苗免疫组经鱼腹腔分别注射1.6项制备的3批AV CA07株发酵菌液，0.4 mL／尾；
对照组经鱼腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。连续观察14 d，每日记录各组鱼的死亡情况。

1.8 免疫原性试验 按1.7 项方法对鲫鱼进行饲养及分组，免疫剂量为0.2 mL／尾。免疫28 d后，疫苗免疫组和对照组均经鱼腹腔注射AV CA07 株菌液（活菌数3.5×107CFU／mL），0.1 mL／尾，攻毒后连续观察7 d，每日记录各组鱼的死亡情况，并按下式计算疫苗的相对免疫保护率。

相对免疫保护率（%）=（1-疫苗免疫组死亡率／对照组死亡率）×100%

2.1 AV CA07株灭活疫苗生产工艺的最佳条件

2.1.1 最佳种子液培养时间 种子液培养12~14 h时，A600达高峰，菌液浊度最大；
随后A600开始下降，见图1。表明AV CA07 株种子液培养时间以12~14 h为佳，14 h活菌数为3.45×109CFU／mL。

图1 AV CA07株种子液的生长曲线Fig.1 Growth curve of AV CA07 strain liquid

2.1.2 最佳培养基 优化发酵培养基、LB 培养基、NB 培养基培养AV CA07 株菌液活菌数分别为6.4×109、4.6 × 109、5.3 × 109CFU／mL，优化发酵培养基的活菌数最高，因此确定该培养基为最佳培养基。

2.1.3 最佳发酵条件

2.1.3.1 接种量 按1%、5%、10%、15%接种量接种AV CA07 株菌液的活菌数分别为 6.2 × 109、7.6 ×109、7.1 × 109、6.9 × 109CFU／mL，接种量为5%时，菌液活菌数最高，随后有所下降。因此确定5%为最佳接种量。

2.1.3.2 通气量 2、4、6、8 L／min 通气量AV CA07株菌液的活菌数分别6.3× 109、8.7× 109、9.0 × 109、8.1×109CFU／mL，通气量为6 L／min时，活菌数最高，因此确定6 L／min为最佳通气量。

2.1.3.3 发酵时间 发酵6、8、10、12 h 时AV CA07株菌液的活菌数分别4.4× 109、7.1× 109、8.8 × 109、8.5 × 109CFU／mL，10 h 达最大，10 ~ 12 h 较稳定，因此确定10~12 h为最佳发酵时间。

2.1.4 最佳灭活条件 28 ℃条件下，当甲醛溶液终浓度为0.30%时，灭活48 h，菌液在平板上依然有菌落长出；
当甲醛溶液终浓度达0.40%以上时，灭活24 h，菌液在平板无菌落长出。37 ℃条件下，当甲醛溶液终浓度在0.30%时，灭活24 h，菌液在平板即无菌落长出。见表1。表明用终浓度0.30%的甲醛溶液于37 ℃灭活24 h，AV CA07株菌液可完全灭活。

表1 AV CA07株菌液在不同条件下的灭活效果Tab.1 Inactivation effects of AV CA07 strain liquid at various conditions

2.2 AV CA07 株灭活疫苗规模化生产工艺的建立AV CA07 株于种子罐和发酵罐培养约10 h 时，菌液A600均达最大值，10~12 h 时较平稳，见表2。确定AV CA07 株最佳培养时间为10~12 h。AV CA07 株在50 L 种子罐和500 L 发酵罐培养12 h时，活菌数分别达6×109和8×109CFU／mL以上，见表3。AV CA07株菌液可完全灭活，营养琼脂培养基无菌落长出。

表2 50 L种子罐和500 L发酵罐AV CA07株培养液的A600Tab.2 A600 of AV CA07 strain culture medium in 50 L seed tank and 500 L fermenter

表3 AV CA07株50 L种子罐和500 L发酵罐培养液的活菌计数（×109 CFU／mL）Tab.3 Viable bacteria count of AV CA07 strain culture medium in 50 L seed tank and 500 L fermenter（× 109 CFU／mL）

2.3 安全性试验 3 个疫苗免疫组及对照组的鱼全部健活，均未出现任何临床症状，摄食、游动及体色均正常，注射部位无红肿，内脏器官无病变，表明该灭活疫苗对鲫鱼具有良好的安全性。

2.4 免疫原性试验 3 个疫苗免疫组鲫鱼死亡数分别为2、1、1 尾，相对免疫保护率分别为93.10%、96.56%、96.56%，均达90%以上。对照组有39 尾鲫鱼死亡，死亡率达97%。

AV 广泛分布于水体环境中，是一种在外界环境中适应性较强的菌种，因此适宜AV生长的培养基种类较多，包括 NB、LB、TSB、BHI 培养基等［11⁃13］，商品化培养基价格普遍较高，规模化发酵培养基要求提高活菌数同时降低成本，因此不适用于规模化生产。本研究对比了优化发酵培养基与NB、LB两种培养基培养AV 菌液的活菌数，结果表明，优化发酵培养基的活菌数更高，适合进行规模化发酵培养。发酵条件直接影响菌株培养最终产物的产量，影响较大的发酵参数包括转速、温度、接种量、pH、通气量等［14⁃17］。本研究建立了AV CA07 株在500 L 罐的规模化制备工艺，种子液以5%接种量接种至发酵培养基，于28 ℃，通气量180 L／min 条件下，200 r／min 发酵培养10~12 h，菌液活菌数约为9.0×109CFU／mL，经3批规模化发酵验证，发酵工艺稳定。在大型发酵罐规模化发酵过程中，受发酵菌液体积的影响，转速受到限制，通气量对最终产物的影响更明显。

常见的化学灭活剂有甲醛、β⁃丙内酯（β⁃propio⁃lactone，BPL）、N⁃乙酰乙烯亚胺（N⁃acetylethylenei⁃mine，AEI）、二乙烯亚胺（binaryethyleneimine，BEI）、盐酸聚六亚甲基胍（polyhexamethylence guaidine hy⁃drochloride and phosphate，PHMG）等，其中甲醛是最传统且应用最广泛的化学灭活剂。甲醛灭活效果受灭活剂的浓度、灭活时间、灭活温度等因素影响，通常以较低使用浓度、灭活时间短即可达到彻底灭活为评价指标。目前多数养殖动物如猪、牛、羊、鹿、水貂、禽类、鱼类的细菌灭活疫苗均是以甲醛溶液作为灭活剂［18⁃25］。本研究对 AV CA07 株菌液的灭活条件优化结果表明，采用终浓度0.30%的甲醛溶液于37 ℃灭活24 h即可完全灭活。

制备的AV CA07株灭活疫苗以高剂量免疫鲫鱼后，疫苗免疫组鱼注射部位无红肿，内脏器官无病变，无死亡，表明制备的灭活疫苗具有良好的安全性。免疫原性试验结果，制备的灭活疫苗对鲫鱼具有显著的免疫保护效果，相对免疫保护率达90%以上。

综上所述，本研究以优化条件制备的AV CA07株灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，且生产工艺稳定，本研究为AV灭活疫苗的规模化制备及产业化应用奠定了基础。