CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年骨质疏松症中的表达

张恒林 吴克弟 王声威 刘景新

海南西部中心医院骨科，海南 儋州 571799

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种老年人常见的全身代谢性骨病，以骨量减少、骨微结构损坏、骨脆性增加和极易发生骨折为主要特征，已成为全球重大的公共健康问题[1]。探索一种早期诊断和筛查OP的可靠生物标志物对该病的防治具有重大意义。近年来研究[2-3]发现，环状RNA(circular RNA, CircRNA)作为重要的分子调节因子，参与调控成骨细胞、破骨细胞和间充质干细胞的功能和分化，其突变、过表达或缺失与骨代谢疾病密切相关，有望成为OP的潜在标志物及治疗靶点。有研究[4-5]指出，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在OP中存在异常表达，其通过调控基因表达和蛋白相互作用参与OP的发生和进展，可能为预测OP的发生及治疗提供重要的信息。然而，关于CircRNA_0001795及CircRNA_0048211对老年OP诊断及其与骨密度(bone mineral density，BMD)的关系尚未明确。因此，本研究通过检测老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211的表达情况，探讨其对老年OP的诊断价值及其与BMD的关系，以期为老年OP患者的诊疗提供帮助。

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年12月在海南西部中心医院进行体检的老年人350名，男性152名，女性198名，年龄65～87(74.58±9.63)岁。纳入标准：(1)年龄≥65岁，临床资料完整；
(2)生活能自理，全程配合本次研究。排除标准：(1)存在内分泌系统疾病、风湿免疫疾病、感染性疾病、血液病、恶性肿瘤以及严重心肺、肝肾、脑血管疾病者；
(2)3个月内服用影响骨代谢药物者；
(3)妊娠期、哺乳期女性及精神障碍者。收集所有研究对象体检时的年龄、体质量指数、白细胞计数(WBC)、血钙 (Ca)、镁(Mg)、磷(P)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、碱性磷酸酶(ALP)、空腹血糖(FBG)及甲状旁腺素(PTH)水平等资料。本研究对象自愿参与并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1OP诊断标准：参考《原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)版》[6]，用T值来判定骨质疏松和骨量情况，T值=(骨密度测定值-同种族、同性别健康成人的骨峰值)/健康成人骨峰值的标准差。T值≤- 2.5为OP，- 2.5T值≥- 1.0为骨量正常。

1.2.2BMD测定：所有研究对象均在体检时采用美国GE公司的双能X线骨密度仪测定腰椎(L1～4)、股骨颈及全髋骨密度，单位为g/cm2，CV 值为1.0 %。

1.2.3CircRNA_0001795及CircRNA_0048211检测：采集研究对象体检时血标本3 mL，离心分离血清置于- 70 ℃冰箱保存待测。使用ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，PCR试剂相关试剂盒均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，试剂批号:20170625。应用实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR, RT-PCR)技术检测CircRNA_0001795(上游：5′-AGCTGTGCAATATGACTCG AGTA-3′，下游：5′-TACAGCTGACGAGTACAGTAG-3′)及CircRNA_0048211(上游：5′-AGTCTAGCCA TCTGATGAAGATA-3′，下游：5′-TACGGCATACAGC TGATCCTG-3′)水平，反应条件为：95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共40个循环。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPADH)为内参基因，采用2-△△Ct法计算CircRNA_0001795及CircRNA_0048211水平。

1.2.4质量控制方法：BMD测定由同一组影像科医师严格按照技术规范进行测量，实验室指标检测严格按照仪器操作规程和试剂盒说明书进行。资料收集过程进行审核和校对，最终由双人双录入系统保存。

1.3 统计学分析

2.1 研究对象基本情况

350名体检者中骨量正常者占14.0%(49人)，骨量减少者占44.6%(156人)，OP者占41.4%(145人)。>80岁年龄段发生OP的人数较多，占62.1%(90/145)。见表1。

表1 研究对象基本情况 (n)Table 1 Basic information of the research objects (n)

2.2 各组临床资料及指标比较

OP组年龄和PTH水平明显高于骨量减少组和正常组，OP组BMD明显低于骨量减少组和正常组，OP组和骨量减少组体质量指数明显低于正常组，OP组和骨量减少组TC水平明显高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)。各组间其他指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组临床资料及指标比较Table 2 Comparison of clinical data and indicators in each

2.3 各组血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平比较

OP组血清CircRNA_0001795表达水平为0.31±0.08，明显低于正常组2.28±0.96(t=16.814，P<0.001)和骨量减少组1.24±0.51(t=11.983，P<0.001)，而且骨量减少组明显低于正常组(t=12.275，P<0.001)，差异均有统计学意义(F=20.613，P<0.001)；
OP组血清CircRNA_0048211表达水平为0.26±0.05，明显低于正常组1.63±0.58(t=13.907，P<0.001)和骨量减少组0.91±0.40(t=9.728，P<0.001)，而且骨量减少组明显低于正常组(t=10.116，P<0.001)，差异均有统计学意义(F=17.950，P<0.001)。见图1。

图1 各组血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平比较Fig.1 Comparison of serum CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 expression levels in each group

2.4 多因素Logistic回归分析老年OP发生的影响因素

以是否发生OP为因变量，将有统计学意义的因素为自变量，进行多因素Logistic回归分析显示，年龄(OR=1.684，95%CI：1.163～2.995)、PTH(OR=2.416，95%CI：1.702～5.883)、CircRNA_0001795(OR=3.108，95%CI：2.493～9.428)及CircRNA_0048211(OR=1.942，95%CI：1.335～4.117)是老年OP发生的影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析老年OP发生的影响因素Table 3 Multivariate logistic regression analysis of influence factor of OP in the Elderly

2.5 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211对老年OP的诊断价值

以正常组作为对照组，CircRNA_0001795为0.85及CircRNA_0048211为0.68时，其诊断OP的曲线下面积(AUC)均大于0.800，二者联合诊断老年OP的AUC最大(0.918，95%CI：0.857～0.977)，其准确性为91.2%。见表4。

表4 CircRNA_0001795及CircRNA_0048211对老年OP的诊断价值Table 4 Diagnostic value of CircRNA_0001795 and CircRNA_0048211 for elderly OP

2.6 老年OP患者血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平与BMD的相关性分析

Pearson相关分析显示，老年OP患者血清CircRNA_0001795表达水平与BMD呈正相关(r= 0.804，P<0.001)，CircRNA_0048211表达水平与BMD呈正相关(r= 0.775，P<0.001)。见图2。

图2 血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平与BMD的相关性Fig.2 Correlation between serum CircRNA_0001795, CircRNA_0048211 expression levels and BMD

OP是一种全身性骨代谢异常的疾病，主要引起疼痛、骨折和脊柱变形等并发症，严重威胁老年人的健康状况和生活质量。OP早期的骨密度变化不大，其早期诊断存在困难。因此，迫切需要寻找新的生物标志物来早期发现OP。CircRNA是一类具有闭环结构的非编码RNA成员，参与骨代谢的基因调控，并通过上调或下调相关基因表达，对破骨细胞、成骨细胞和骨髓间充质干细胞的分化、增生、迁移和凋亡产生影响，在OP调控中发挥重要作用[7-8]。越来越多的证据[9-10]证明，CircRNA不仅可调节成骨细胞的代谢，而且对破骨细胞的增殖、分化及凋亡等方面均起重要的调控作用，有望成为OP诊断及治疗的潜在分子标志物。Liu等[11]研究发现，OP患者存在CircRNA的差异表达，其通过调控成骨细胞的相关基因和蛋白的表达，促进了骨髓间充质干细胞成骨分化，进而参与OP的发病机制。Chen等[12]研究表明，CircRNA_0048211可通过调控相关成骨分化基因的表达来参与骨代谢的过程，对骨的形成或吸收产生影响，是OP发生的潜在积极调节因子。

本研究的350名体检者中发生OP者占41.4%，其中>80岁年龄段发生OP的人数较多，与付梦菲等[13]研究结果一致。高龄是发生OP的影响因素，可能是随着年龄增长，骨重建功能减退，性激素缺乏导致骨吸收加速，骨量减少，进而更易发生OP。本研究OP组血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平均明显低于骨量减少组和正常组，而且骨量减少组明显低于正常组。说明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表达，随着BMD减少，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平明显下降，其可能通过促进骨量减少参与老年OP的发病过程。相关分析也显示，CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平与BMD均呈正相关，进一步说明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211能反映骨量变化状况，其与老年OP的BMD减少密切相关，可能参与老年OP的发生发展。Zhi等[14]研究发现，CircRNA作为细胞信号和相关基因表达的重要调节因子，参与调控成骨细胞的代谢和破骨细胞的分化，在OP的发生和进展起着重要作用。Li等[15]研究表明，CircRNA通过调节成骨细胞、破骨细胞和骨髓基质细胞的生理和发育过程，参与了骨代谢及维持骨内稳态，对骨微环境的细胞分化、增殖、凋亡和自噬产生影响，从而调控OP的发生。

PTH是调节人体内钙磷代谢的主要激素，通过影响其骨密度与骨质的微结构，提高对骨的分解及吸收作用，降低骨量，是老年OP发生的影响因素。李霞等[16]研究证实，高水平PTH可使破骨细胞的数目和活力增加从而使骨吸收强于骨形成，导致骨溶解，促进了OP的发生与进展，是导致OP发生的主要因素。本研究CircRNA_0001795及CircRNA_0048211表达水平异常均对老年OP发生产生极大影响，其可能通过调节破骨细胞、成骨细胞和间充质干细胞影响骨代谢有关[17]。本研究中CircRNA_0001795及CircRNA_0048211对老年OP诊断均具有一定的价值，二者联合诊断老年OP的AUC最大，其准确性最高。说明CircRNA_0001795及CircRNA_0048211联合检测对老年OP的诊断效能较高，可作为诊断老年OP的分子标志物。Xiang等[18]研究也表明，CircRNA在OP患者中呈低表达，对OP的诊断具有很大的价值，是一种有前途的无创性分子标志物。

综上所述，血清CircRNA_0001795及CircRNA_0048211在老年OP患者中呈低表达，其与BMD密切相关，二者联合检测对老年OP诊断具有很好的价值，可作为诊断老年OP的分子标志物。但本研究为单中心的临床研究，无法全面评估CircRNA在老年OP中的长期变化，未来仍需进一步的深入证实。