肝硬化患者肠黏膜通透性改变与肝功能分级的关系研究

王丽 张瑞

郑州市第六人民医院医学检验科，郑州 450015

肝硬化系由饮酒、乙型或丙型肝炎及自身免疫性疾病等一种或多种病因引发的慢性弥漫性肝脏病变，随疾病进行性发展可诱发肝性脑病、消化道出血或自发性腹膜炎等并发症，可对患者健康造成严重威胁［1-4］。据全球疾病负担（GBD）调查研究指出，全球肝硬化患者年龄标化发病率为132.5/10万［5］。而基于我国调查研究显示肝硬化发病率为424.4/10万，呈逐年上升趋势，且以15～49岁男性高发［6］。故现今防治重点在于早期发现及有效治疗。自Marshall学者于1988年首次提出“肠-肝轴”概念以来，陆续有研究显示肠道微生态改变可一定程度反映肝硬化发生、发展［7-10］。鉴于目前研究多采用传统技术（粪便细菌培养）及分子生物学技术［实时荧光定量PCR（RT-PCR）、宏基因组测序等］，但存在相应局限，譬如粪便细菌培养耗时耗力，且易受外界因素影响，分子生物学技术费用高昂，操作复杂，且结果准确性依赖数据库及算法，故难以于临床广泛应用［11-12］。考虑肠道微生态改变不仅包括菌群变化，还与肠黏膜通透性密切相关。兹本文旨在寻求肠黏膜通透性特异性指标，并进一步分析其与肝硬化及肝功能分级的关系，现报道如下。

1.一般资料

以2020年11月至2022年4月经郑州市第六人民医院收治肝硬化患者96例为观察组，按Child-Pugh肝功能分级分为A、B、C 3个亚组；
同期选择无肝硬化的健康体检者40例为对照组。纳入标准：（1）符合《肝硬化诊治指南》中有关标准［13］；
（2）临床资料完备；
（3）经招募受试者自愿参与研究，并签订同意书。排除标准：（1）伴发恶性肿瘤；
（2）妊娠哺乳期女性；
（3）合并严重心、脑、肾等器质性病变；
（4）患有自身免疫性疾患；
（5）近期（＜4周）抗生素、胃肠动力药或生物制剂服用史；
（6）罹患炎症性肠病、功能性消化不良等胃肠道疾病。

本研究经郑州市第六人民医院伦理委员会审批通过（20200616）。

2.亚组分组依据

观察组依据Child-Pugh肝功能分级划分亚组，若分级评分5～6分，计为A级，归入A组（35例）；
若分级评分7～9分，计为B级，归入B组（43例）；
若分级评分≥10分，计作C级，归入C组（18例）。

3.方法

（1）肠道主要菌群变化测定方法：入组患者于排便后2 h收集粪便标本并储放于密闭盒内备用。用天平称取0.5 g用生理盐水作定量稀释，并于选择培养基进行接种作细菌培养，培养细菌种类包括肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌等。使用VTTEK-AMS型全自动微生物鉴定分析系统（法国梅里埃公司）用以细菌鉴定及数目定量。公式：数目≈lg菌落形成单位（CFU）/g。（2）肠黏膜通透性指标测定方法：入组患者于翌日清晨空腹状态下行5 ml肘静脉血收集，作离心处理（转速3 000 r/min，时间10 min，离心半径13.5 cm），分离血清后采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定D-乳酸（D-LAC）、内毒素（ETX）及二胺氧化酶（DAO）等肠黏膜通透性指标，试剂盒均购自上海晶抗生物工程有限公司，严格按说明书规范操作。

4.统计学方法

使用SPSS 22.0软件对收集汇总数据作统计分析，计量资料经Kolomgorov-Smirnov检验均符合正态分布，以（）表示，多组间比较行F检验，两组间行独立样本t检验，计数资料以例（%）表示，行χ2检验，行Pearson相关性分析分析肠黏膜通透性指标之间的相关性，行Spearman相关性分析分析肠黏膜通透性指标与Child-Pugh肝功能分级的相关性，并使用受试者工作特征曲线（ROC）分析肠黏膜通透性指标的预测价值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.基线资料比较

4组性别、年龄及A、B、C组病因比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 肝硬化患者与健康体检者基线资料比较

2.肠道主要菌群变化比较

A、B、C组肠杆菌、肠球菌数目高于对照组，乳杆菌、双歧杆菌数目低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
随Child-Pugh肝功能分级提高，肠杆菌、肠球菌数目呈上升趋势，乳杆菌、双歧杆菌数目呈下降趋势，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 肝硬化患者与健康体检者肠道主要菌群变化比较（lgCFU/g，）

表2 肝硬化患者与健康体检者肠道主要菌群变化比较（lgCFU/g，）

注：对照组为无肝硬化的健康体检者，A组为Child-Pugh分级A级肝硬化患者，B组为Child-Pugh分级B级肝硬化患者，C组为Child-Pugh分级C级肝硬化患者；
与对照组比较，aP＜0.05；
与A组比较，bP＜0.05；
与B组比较，cP＜0.05

乳杆菌9.85±1.01 9.08±0.63a 8.60±0.48ab 8.04±0.76abc 22.325＜0.001组别对照组A组B组C组F值P值例数40 35 43 18肠杆菌8.12±0.68 8.61±0.42a 8.95±0.39ab 9.22±0.56abc 20.126＜0.001肠球菌7.18±0.71 7.75±0.46a 8.42±0.87ab 9.28±0.63abc 30.248＜0.001双歧杆菌9.97±0.96 9.15±0.58a 8.54±0.61ab 7.96±0.82abc 28.936＜0.001

3.肠黏膜通透性指标比较

A、B、C组D-LAC、ETX、DAO水平均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
随着Child-Pugh肝功能分级提高，B、C组D-LAC、DAO水平均高于A组（均P＜0.05），但B、C组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；
C组ETX水平均高于A、B组（均P＜0.05），但A、B组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 肝硬化患者与健康体检者肠黏膜通透性指标比较（）

表3 肝硬化患者与健康体检者肠黏膜通透性指标比较（）

注：对照组为无肝硬化的健康体检者，A组为Child-Pugh分级A级肝硬化患者，B组为Child-Pugh分级B级肝硬化患者，C组为Child-Pugh分级C级肝硬化患者；
D-LAC为D-乳酸，ETX为内毒素，DAO为二胺氧化酶；
与对照组比较，aP＜0.05；
与A组比较，bP＜0.05；
与B组比较，cP＜0.05

DAO（U/L）3.65±1.63 34.06±10.36a 40.12±11.72ab 43.07±14.20ab 61.254＜0.001组别对照组A组B组C组F值P值例数40 35 43 18 D-LAC（mg/L）3.92±2.27 5.83±2.63a 8.75±3.27ab 10.16±3.58ab 24.642＜0.001 ETX（U/L）3.72±2.51 10.53±4.36a 12.67±5.12a 23.08±9.37abc 38.718＜0.001

4.肠黏膜通透性指标与Child-Pugh肝功能分级的相关性分析

经Pearson相关性分析显示，D-LAC与ETX、DAO呈正相关（r=0.595、0.489，均P＜0.05）；
ETX与DAO呈正相关（r=0.353，P＜0.05）；
经Spearman相关性分析显示，D-LAC、ETX、DAO与Child-Pugh肝功能分级呈正相关性（r=0.468、0.470、0.236，均P＜0.05）。见表4、表5。

表4 96例肝硬化患者肠黏膜通透性指标之间的相关性

表5 96例肝硬化患者肠黏膜通透性指标与Child-Pugh肝功能分级的相关性

5.肠黏膜通透性指标预测Child-Pugh肝功能分级的诊断价值分析

经ROC分析显示，D-LAC预测Child-Pugh肝功能分级的诊断价值最高，曲线下面积（AUC）为0.772，最佳截断值为6.60 mg/L，此时灵敏度、特异度分别为78.69%、65.71%。见表6、图1。

表6 肠黏膜通透性指标预测96例肝硬化患者Child-Pugh肝功能分级的诊断价值分析

图1 肠黏膜通透性指标预测96例肝硬化患者Child-Pugh肝功能分级的ROC

“肠-肝轴”概念提示肝脏与肠道及其微生物菌群存在双向关系，肝脏合成胆汁酸、磷脂、胆固醇及代谢物等物质以胆汁形式流经小肠上部-空肠-回肠-结肠通路，肠道及其微生物菌群发挥物质代谢作用并以血液形式经门静脉吸收再次流回肝脏［14-16］。当肝硬化发生后，受损肝脏功能毒素清除能力减弱使机体免疫功能下降，进而破坏肠-肝屏障导致肠道及其微生物菌群失调，而肠道及其微生物菌群失调可进一步加重肝脏代谢负担损伤肝功能进一步促进肝硬化进展［17］。故明确肝硬化患者肝功能与肠道微生态变化的关系对于肝病防治具有重要意义。就肠道微生态分析，肠道内微生物逾100万亿，微生物群1 000～1 150种，按功能可分为益生菌（乳酸菌、双歧杆菌等肠道优势菌）、共生菌（肠杆菌、肠球菌等条件致病菌）、过路菌（变形菌门、绿脓杆菌等致病菌）。于正常情况下，过路菌含量较少不致病，共生菌一定数目下可发挥一定生理功能，益生菌可调节机体免疫，并可增加机体抗炎及抗感染能力［18-19］。限于医院尚不具备分子生物学技术条件，本文基于粪便细菌培养用以评估肠道菌群变化，结果显示，A、B、C组肠杆菌、肠球菌数目均高于对照组，乳杆菌、双歧杆菌数目均低于对照组。这表明肝硬化患者肠道菌群数目发生改变，且随Child-Pugh肝功能分级提高，乳杆菌、双歧杆菌数目明显降低，肠杆菌、肠球菌数目明显升高。究其原因在于，肝硬化发生后因胆汁酸分泌减少，可促进肠杆菌、肠球菌等条件致病菌过度生长，数目超过限定阈值后可变为致病菌，并对乳杆菌、双歧杆菌等优势菌产生抑制，进而破坏胃肠屏障进一步损害免疫防御功能，由此致病菌通过释放细胞炎症因子可加剧肝硬化发展［20］。这与Dubinkina等［21］研究证实酒精性肝硬化中梭菌目与拟杆菌目中多个菌种有明显降低有一定类似。而本文纳入对象包括但不局限于酒精性肝硬化，并排除特殊性自身免疫性肝硬化，虽整体体现出一致性趋势，但关于不同病因肝硬化肠道菌群变化有待研究作进一步细分。

鉴于上述传统培养方法存在耗时耗力，培养要求高，影响因素杂等缺陷，将其用于临床肝硬化诊疗存在不足，亟待寻求实时、可靠特异性指标用以准确反映肝硬化发生、进展。考虑到肝硬化所致肠道菌群变化表现为肠黏膜通透性增加，故寻找可靠肠黏膜通透性特异性指标可一定程度反映肝硬化严重程度。于正常情况下，机体门静脉中存在少量ETX用以激活肝脏内皮系统提高机体免疫力，因肝硬化可诱使肠道致病菌大量繁殖破坏肠黏膜屏障功能，肠黏膜通透性上升，ETX可进入血循环导致浓度升高，并形成内毒素血症进一步加重肠黏膜损伤形成恶性循环。故测定血清ETX水平可一定程度反映肠黏膜通透性。D-LAC作为肠道细菌酵解产物，正常情况下于血液中含量较低，但肠黏膜通透性升高时，肠道细菌合成大量D-LAC通过肠黏膜屏障进入门静脉循环，且肝脏无法吸收D-LAC，故监测血清D-LAC水平可有效反映肠黏膜通透性。而作为多胺物质分解代谢酶的DAO广泛存在于小肠黏膜或绒毛上皮细胞，当肠黏膜屏障损伤后，肠黏膜细胞脱落进而肠腔进入血循环，由此导致血中DAO含量上升。故DAO亦可对肠黏膜通透性有一定反映［22-24］。本文结果显示，A、B、C 组 D-LAC、ETX、DAO水平均高于对照组。这提示肝硬化患者肠黏膜通透性提高表现为D-LAC、ETX、DAO上升。而依据Child-Pugh肝功能分级进一步分析发现，B、C组D-LAC、DAO水平均高于A组，但B、C组间比较无明显差异，C组ETX水平高于A、B组，但A、B组间比较无明显差异。据此表明肠黏膜通透性改变与Child-Pugh肝功能分级存在一定相关性。而不同分级间部分指标差异不明显，究其原因有以下：（1）Child-Pugh肝功能分级使用了腹水、肝性脑病等主观性指标，且仅分为3个级别，可能导致分值不同患者均归为一组，由而导致病情严重程度与肠黏膜通透性指标水平存在一定波动；
（2）所纳入C组患者病例仅18例，且评分与B组相近。而由相关性分析显示，D-LAC、ETX、DAO与Child-Pugh肝功能分级呈正相关，且D-LAC、ETX、DAO之间易呈正相关。这提示D-LAC、ETX、DAO可作为肠黏膜通透性可靠指标。这与相关研究有一定类似［25］。且通过ROC作进一步分析结果显示，D-LAC用于预测肝硬化肝功能严重程度的诊断价值最高，其次为ETX、DAO。这表明通过D-LAC、ETX、DAO可对肝硬化患者肝功能严重程度进行评估，且上述指标均可快速、实时获得，临床应用具有可行性。

综上所述，肝硬化患者因肠道菌群紊乱、肠黏膜通透性改变导致肠道微生态失调可使疾病病情加重，不利于预后。通过无创、可靠且实用肠黏膜通透性指标监测有助于为肝硬化患者诊疗提供重要指导。

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