不同大豆分离蛋白性质及其制备人造肉表观品质的研究

江睿生，王 娜，王治力，王春波，霍金杰，王海观，王振国，王 哲，肖志刚

(东方集团哈尔滨福肴食品有限公司1，哈尔滨 150001) (沈阳师范大学粮食学院2，沈阳 110034) (辽宁大学轻型产业学院3，沈阳 110036)

PBAM的市场潜力大[1,2]，是近年来研究的热点之一。PBAM[3]是以植物蛋白为原料，以双螺杆挤压机为设备，在高温、高压和高剪切条件下蛋白分子展开、团聚、聚集和交联，得到具有各向异性结构的组织化蛋白。此外，作为原料的植物蛋白中必须含有较多的含硫氨基酸，这是因为植物蛋白分子链在打开时，会暴露足够多的巯基，经过氧化形成新的二硫键，并作为组织化蛋白的主要分子结合作用力[4,5]。SPI是最常见的植物蛋白原料之一，从营养价值方面上看，大豆蛋白有益于改善人体脂质代谢[6]和预防心血管疾病[7]。它还含有多种人体必不可少的氨基酸[8]，这使得加工后的大豆蛋白的蛋白质消化率校正的氨基酸评分为1.00，可与动物衍生食品如肉类、鸡蛋和乳制品媲美[9]。从功能性质上看，SPI具备良好的持水性和凝胶性，应用到肉制品加工中对产品有不同程度的改善。刘广娟等[10]研究认为，SPI添加量在4%以下可以改善猪肉香肠的保水性。朱佳倩等[11]发现，SPI的添加可以提高鸡肉肌球蛋白凝胶的保水性和凝胶微观结构，因为SPI增强了鸡肉中肌原纤维蛋白的保水性和凝胶性。SPI也常常被用于制备PBMA，Fang等[12]研究机械能对大豆理化性质的影响，发现机械能增加可以提高大豆基人造肉的抗拉伸强度，同时使其表面变暗。Katarzyna等[13]研究认为，大豆浓缩蛋白纤维结构的形成与其本身干物质的含量，挤压温度和碳水化合物的存在有重要的关系。Katarzyna等[14]还研究了剪切过程对纤维结构形成的影响，发现大豆分离蛋白和谷朊粉可以更好地在机筒内混合、变形、重排，形成了规律的层状结构。

目前对于SPI的质量状况评价，多是基于大豆蛋白粉的标准GB/T 22493—2008，参考蛋白粉的基本参数如理化指标(蛋白含量、水分、灰分和粗纤维等)、感官性质(形态、色泽、气味和杂质等)和卫生指标等范畴内进行生产，并不关注在食品方面对于特定SPI功能性质或结构性质的需求，而原料性质的优劣可能会反过来限制其在食品中的应用。因此，开发满足特定食品需求的SPI类型可成为今后PBMA要关注的重点之一。SPI用于制备PBAM，需要在挤压机内部与其他蛋白原料进行反应，这一热反应过程所制备的产品表观性质可能与蛋白本身的功能性质有关联，如溶解性、持水性和凝胶性等，同时还可能与SPI自身的巯基含量、二硫键含量以及其表面疏水作用有关。PBAM成型过程中涉及的二级结构的变化[15,16]，可以影响PBAM的表观性质的变化，这可能与SPI的二级结构的构成差异有关。杨锋等[17]的研究较好地解释了不同SPI功能性质与结构性质的关联性，但目前尚不清楚不同SPI的功能性质与结构性质与其制备PBAM的表观性质之间是否存在联系。

本研究以不同种类的SPI为原料，利用高水分挤压技术生产PBAM，通过分析PBAM的表观品质与SPI的功能性质和结构性质关系，筛选出较优的SPI种类，并找到影响SPI制备PBMA的优劣的关键功能性质或结构性质，旨在为后续特定PBMA原料SPI的开发和PBMA品质的改良提供参考。

1.1 材料

豌豆蛋白粉、谷朊粉。

1.2 仪器与设备

DS 56-Ⅲ型双螺杆挤压膨化机，CR-400色彩色差计，CT3质构仪，nicolet iS10傅里叶红外光谱仪，贝克曼高效离心机。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

按照SPI、谷朊粉、豌豆蛋白的质量比例(9∶7∶4)配制原料粉，设置6个不同SPI实验组(A1、A2、A3、A4、A5、A6)。调节双螺杆挤压机参数：进水速度为13.5 kg/h、进料速度为8 kg/h、螺杆转速为280 r/min，各挤压区段从进料区、混合区、剪切区、蒸煮1区到蒸煮2区的温度依次设置为：60、80、120、160、160 ℃，挤出阶段冷却模具温度设置为50 ℃，制得的PBAM备测质构、色差、拉伸力和组织化度。

1.3.2 质构测定

参考张金闯[18]的测定方法，样品裁切成25 mm×25 mm×10 mm的方块，选用探头为TA-5，设置质构仪为TPA模式，测试速度为1 mm/s，测试形变量为15%，初负载为0.1 N。测定样品的硬度、弹性和咀嚼性，每样重复测定5次，取平均值，平行测定3次。

1.3.3 组织化度测定

样品裁切如图1所示，长宽均为20 mm，厚度为10 mm。采用TA-SB单刀剪切夹具对样品进行剪切测试，设置：测试速度1.0 mm/s；
压缩程度为样品厚度的25%；
初负载为5 g。定义沿着挤出方向的剪切力为平行切力，垂直于挤出方向的剪切力为垂直切力。组织化度为垂直切力与平行切力的比值。每个样品测定1次，平行测定3次。

注：虚线位置为探头剪切位点。图1 组织化度测定样品形状示意图

1.3.4 拉伸力测定

参考李里特[19]对于拉伸力的测定方法，样品裁切如图2所示，厚度为5 mm。采用TA-DGA探头进行拉伸测试，质构仪设置为张力模式，设置测试速度为1 mm/s，形变量为15%，初负载5 g。每个样品重复测定3次，取平均值，平行测定3次。

图2 拉伸力测定样品示意图

1.3.5 色泽测定

使用色差仪同时测定样品的L*、a*、b*和ΔE的数值。每个样品进行5个不同位置色泽的平行测定，去掉异常值，取平均值。

1.4 SPI原料性质测定

1.4.1 持水性测定

称取0.1 g蛋白样品溶于5 mL 0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲溶液，之后放入10 mL的离心管中，室温下涡旋3 min后，5 000 r/min离心20 min，根据公式计算蛋白质原料的持水性，平行测定3次。

式中：m为蛋白的质量/g；
m1为蛋白的质量+离心管质量/g；
m2为离心管除去上清液后的质量/g。

1.4.2 溶解性测定

分别称取0.1 g蛋白样品，加入10 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌1 h后8 000 r/min离心10 min，取上清液，用凯氏定氮法测得上清液中蛋白质含量根据公式计算蛋白质的溶解性，平行测定3次。

式中：e为上清液蛋白含量/%；
E为样品蛋白含量/%。

1.4.3 凝胶性测定

凝胶制备：将蛋白样品配制成10%的蛋白质溶液，用保鲜膜封口，于95 ℃水浴加热30 min后迅速冷却，放置于4 ℃冰箱内冷藏静置24 h后取出，检测溶液是否成胶，判断SPI是否具有凝胶性。

凝胶质构测定：采用探头TA-5，设置质构仪为TPA模式，测试速度1 mm/s，初负载为0.1N，测定凝胶的硬度、弹性、黏性，每样平行测定3次。

1.4.4 疏水相互作用

参照文献[20,21]做出一定修改，使用ANS作为荧光探针测定表面疏水性。取样品0.5 g蛋白溶于25 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液，均质后8 000 g离心30 min。取上清液并按0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 g/mL进行稀释，之后分别加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，避光静置10 min。在本实验中激发波长为390 nm，发射波长为470 nm。利用最小二乘法进行曲线拟合求出直线斜率即为表面疏水性。

1.4.5 巯基、二硫键含量测定

参考罗明江等[22]的方法，取75 mg蛋白粉样品，加入4.7 g盐酸胍，用Tris-甘氨酸缓冲溶液定容到10 mL。测巯基时，取溶液1 mL，依次加入4 mL(8 mol/L)Urea+(5 mol/L) 盐酸胍混合液、50 μl 0.4% Ellman’s溶液，混匀，在412 nm测取吸光值。

测二硫键时，取溶液1 mL，加入0.05 mL巯基乙醇和4 mL(8 mol/L)Urea+(5 mol/L)盐酸胍混合液，在25 ℃保温1 h，加入10 mL 12%三氯乙酸，继续25 ℃保温1 h，之后6 000 g离心20 min，用5 mL 12% 三氯乙酸清洗沉淀物2次，在沉淀物中依次加入10 mL (8 mol/L) Urea和40 μL 0.4% Ellman’s溶液，混匀，在412nm测取吸光值。

式中：A为吸光值；
D为稀释因子(计算巯基含量时，D为5.02)；
C为样品质量浓度/mg/mL。

式中：F2为还原后SH数量；
F1为还原前SH数量；
F1和F2均由二硫键含量公式计算得到，其中，D为10。

1.4.6 傅里叶红外光谱测定

根据郭莲东等[23]的红外测定方法，称取1 mg蛋白样品和100 mg溴化钾，制备透明片，并采集500～4 000 cm-1室温红外光谱。每个光谱采用Omnic软件(version 8.0)分析，选取酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)用Peakfit软件(version 4.12)进行拟合分析。采用SPSS统计软件version 18.0对拟合后数据进行分析。

1.5 数据统计分析

所得实验结果均采用平均值和标准差表示，并采用统计学软件SPSS 18.0将实验数据进行单因素方差分析(P<0.05为差异显著)、主成分分析和相关性分析(Pearson相关系数法)。

2.1 SPI原料功能性质分析

蛋白的持水性和溶解性可能关系着蛋白物料与水混合在机筒内的反应程度。陈锋亮等[24]认为，物料水分的增加会降低筒内熔融体的黏度，减少蛋白在机筒内所受到的机械作用力，进而降低蛋白质亚基聚合交联的程度，进一步地，这是硬度、咀嚼度和拉伸力降低的原因之一。如表1所示，A1和A3的SPI持水性最高，而A4和A5的SPI的持水性则最低。溶解性方面，A1的SPI的溶解性差，均值为8.53%，这可能与A1的SPI表面疏水性的值最大有关[24]。此外，A3、A5和A6的SPI溶解性均大于10%，其中，A3的SPI溶解性最好。植物蛋白在挤压机内的反应直至形成具有纤维取向的结构的过程与蛋白热致凝胶的形成类似[25,26]。Liu等[27]比较了大豆蛋白凝胶和大豆基人造肉的形成都是靠着二硫键和非公价相互作用，不同的是，热诱导凝胶化过程时，非共价键比二硫键更起主导作用，而对于挤出物而言，非共价键和二硫键都很重要。SPI经过加热后冷却可形成凝胶，可应用于肉糜制品可以使其具有较好的凝胶结构[28,29]。此外，与具有较好凝胶性能的动物蛋白一起可形成刚性更强的凝胶网状结构[30]，这对于提升口感和质地以及留住水分、风味物质有重要作用。测定SPI凝胶的质构后发现，A1的SPI的凝胶弹性最高，且具有较高的黏性。A2的SPI的凝胶硬度和黏性最高，且具有较高的弹性。相比较下，A6的SPI的凝胶硬度、弹性和黏性较差，这可能与A6的SPI制备的PBAM组织化度低和咀嚼性较差有关。

表1 不同SPI原料的功能性质

2.2 SPI结构特性分析

如表2所示，A1的SPI表面疏水性远大于其他5组，而表面疏水性较低的SPI有A3和A5,这可能与SPI的功能性质和二级结构有关联[31]。齐宝坤等[32]研究认为，SPI的表面疏水性会随着游离巯基的增加而增大，二级结构中无规则卷曲含量也随之增加。与之不同的是，A1的SPI巯基含量较其他组含量低，A3和A5的SPI巯基含量高于其他组。同时A1的SPI的无规则卷曲结构含量最低，分子中无序结构较少，而与之对应的表面疏水性最高，这可能与SPI溶解性差或者与提取方法不同有关。PBAM纤维结构形成依赖于二硫键的生成，这往往是由SPI本身的巯基氧化生成和二硫键断裂重组转化而来[33]。以巯基和二硫键含量之和作为对比依据，可发现A3SPI的含量最高，A1、A5和A6的SPI的含量相比其他组低，这与硬度的变化趋势相近。

表2 不同SPI原料结构性质

表3 不同SPI对PBAM的表观品质的影响

2.3 PBAM表观性质分析

如表3所示，A5和A6的SPI所生产的植物基PBAM硬度较其他组低，而A1、A3和A4的硬度均在16 N以上，咀嚼性的变化趋势与硬度相同。蒋华彬[38]研究发现，PBAM的硬度的变化与物料水分呈负相关。不同SPI的持水性和溶解性存在差异，因而PBAM硬度和咀嚼性的不同可能与蛋白本身的溶解性、持水性的交互作用相关。SPI的弹性指数均大于0.90，变化幅度相比其他项小。A1、A4和A6的SPI所生产的PBAM的拉伸力较高，A5的最低。在色泽上的对比，L*表示样品与白板之间的颜色差距，L*越大，样品表面越亮，而与L*相反的是ΔE。a*和b*分别代表红绿值和黄蓝值，它们的变化与蛋白在挤压机机筒内发生的美拉德反应[39,40]有关。A2和A5的PBAM的L*相比于其他组的低，对应的a*和b*也较小，说明两者的颜色较深，而A1的L*值最高，在a*和b*的值也最高。这可能是SPI的表面疏水性强，在热机械力作用下暴露了更多的疏水基团，水分子在蛋白表面铺展开来，使得单位体积的物料含水率增加，进而使得PBAM的明亮程度L*增加[41],进一步地，水分子带着热量进入到蛋白分子内部，促进了羰氨反应的进行，a*和b*增大。组织化度表示PBAM的纤维化程度，A3和A6的SPI所生产的PBAM组织化度都较低，而A2的组织化度最高。

2.4 相关性分析

如表4所示，PBAM的硬度受持水性和二硫键含量变化的影响，在P<0.05水平上呈正相关关系，其中二硫键的相关性系数大于持水性。与此同时，咀嚼性的变化与二硫键含量在P<0.01水平上呈正相关关系。因此，提高原料SPI二硫键的含量，可以增加其制得PBAM的硬度。弹性指数和组织化度受溶解性和凝胶弹性的影响而变化，其中弹性指数和组织化度与SPI溶解性在P<0.01水平上呈负相关关系，与凝胶弹性在P<0.01水平上呈正相关关系，但从相关系数的绝对值比较看，SPI本身的溶解性对于PBAM的弹性指数和组织化度的影响更大。拉伸力的变化在P<0.05水平上与SPI的凝胶硬度和黏性呈反比，且相关性系数在数值上比较接近。色泽的的变化主要受表面疏水性的影响，在P<0.01的水平上表面疏水性与PBAM的L*、a*、b*和ΔE均存在极显著的相关性，这说明SPI的表面疏水性是决定PBAM色泽变化的关键因素。此外，SPI的二级结构含量对于其制备的PBAM的表观品质影响相比其他性质而言较小，它可能通过影响SPI的原料功能性质，进一步影响所制备的PBAM，但从制备特定PBAM的原料SPI的角度上看，则可以忽略其二级结构的组成，更重视原料一些外在的功能性质。

表4 各成分指标相关性系数表

2.5 主成分分析

F1=0.188X1,1+0.212X2,1+0.230X3,1+0.147X4,1+0.253X5,1+0.312X6,1+0.293X7,1+(-0.237)X8,1+0.103X9,1+0.153X10,1+(-0.220)X11,1+(-0.086)X12,1+0.183X13,1+(-0.072)X14,1+0.312X15,1+(-0.204)X16,1+0.204X17,1+(-0.253)X18,1+0.017X19,1+0.192X20,1+(-0.023)X21,1；

F2=(-0.078)X1,2+0.218X2,2+(-0.015)X3,2+(-0.203)X4,2+(-0.192)X5,2+(-0.044)X6,2+(-0.149)X7,2+0.206X8,2+0.367X9,2+(-0.227)X10,2+(-0.289)X11,2+0.317X12,2+0.254X13,2+0.230X14,2+(-0.035)X15,2+(-0.149)X16,2+0.105X17,2+(-0.073)X18,2+(-0.280)X19,2+0.151X20,2+0.220X21,2；

F3=0.331X1,3+0.057X2,3+0.296X3,3+(-0.079)X4,3+(-0.188)X5,3+0.012X6,3+(-0.129)X7,3+0.196X8,3+0.053X9,3+0.071X10,3+0.025X11,3+(-0.086)X12,3+0.102X13,3+(-0.050)X14,3+(-0.119)X15,3+0.177X16,3+0.150X17,3+0.067X18,3+0.217X19,3+(-0.201)X20,3+0.017X21,3；

F4=(-0.025)X1,4+(-0.070)X2,4+(-0.054)X3,4+(-0.308)X4,4+0.021X5,4+0.043X6,4+0.070X7,4+0.001X8,4+(-0.050)X9,4+0.322X10,4+0.031X11,4+0.121X12,4+0.200X13,4+0.288X14,4+0.132X15,4+0.299X16,4+(-0.039)X17,4+0.171X18,4+(-0.088)X19,4+0.239X20,4+(-0.406)X21,4；

F5=0.139X1,5+0.001X2,5+0.128X3,5+0.232X4,5+0.093X5,5+(-0.195)X6,5+(-0.053)X7,5+(-0.123)X8,5+(-0.060)X9,5+0.128X10,5+0.111X11,5+0.177X12,5+(-0.180)X13,5+0.336X14,5+0.033X15,5+0.049X16,5+0.295X17,5+0.074X18,5+(-0.170)X19,5+(-0.059)X20,5+0.134X21,5。

表5 主成分特征值和贡献率

5个主成分从不同方面反映了不同SPI的总体水平，为对各种SPI做出综合性的评价，需要将每个主成分对应的得分和对应的方差贡献率进行权重加和，因此建立综合评价函数F=0.342F1+0.248F2+0.145F3+0.108F4+0.059F5,计算各SPI的综合得分，分数高低可反映不同SPI生产PBAM方面的原料品质高低。由表6可知，5个主成分综合得分前3的为A1、A2和A4，得分最低是A6。

表6 不同SPI的品质综合得分和排名

通过主成分分析和相关性分析研究SPI功能性质和结构性质与其制备PBAM的表观品质的关系，结果表明，SPI的功能性质中的表面疏水性、溶解性以及结构性质中二硫键的含量影响着其制备PBAM的表观品质。SPI综合得分最高的为1.456，具有最高的表面疏水性，可以促进PBAM色泽中L*、a*、b*的增加，使其具有更亮的色泽。SPI原料溶解性的降低可以促进其制备的PBAM的组织化度和弹性指数的增加。SPI原料二硫键的含量增加可以促进其制备的PBAM硬度和咀嚼性的增加。