FAM83H,及其天然反义转录本FAM83H-AS1在肺腺癌和卵巢癌发生发展中的作用

刘梦真 孙蓉蓉 刘艳华 张有为

1.徐州医科大学临床学院，江苏徐州 221009；
2.江苏省徐州市中心医院肿瘤内科，江苏徐州 221009

恶性肿瘤已成为我国居民的主要死因，探索肿瘤发生发展中的关键基因具有重要意义[1]。FAM83H 位于染色体8q24.3，是FAM83 家族成员之一，最初因其在牙齿发育中的重要作用被关注，FAM83H 在肝细胞癌、肾癌、胃癌、胰腺癌和宫颈癌等肿瘤中高表达，并促进癌细胞的生长、侵袭和转移[2-6]。FAM83H-AS1 位于FAM83H 的对侧，是其天然反义转录本，二者以头对头（5’-5’）形式互补重叠。研究表明，FAM83H-AS1 是多种肿瘤潜在的诊断、预后标志物和治疗靶点[7-9]。本研究拟在泛癌种水平研究FAM83H 和FAM83H-AS1 在肿瘤发生发展中的生物学作用。

1.1 实验材料

CCK-8 购于Signalway Antibody（CP002）；
Transwell小室购于Costar（3422）；
Trizol 购于美国Invitrogen 公司（1596026）；
逆转录试剂盒购于Fermentas（#K1622）；
SYBR Green PCR 试剂盒（#K0223）、BCA 蛋白定量试剂盒（PICPI23223）、兔抗人FAM83H 多克隆抗体（PA5-55094）购于Thermo；
兔抗人GAPDH 单克隆抗体（#5174）购于CST；
羊抗兔HRP 标记二抗（A0208）、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（C1036）购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 生物信息学分析

在线分析FAM83H 基因在恶性肿瘤中的表达及预后，测试数据集来自基因表达谱动态分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn）[10]。

1.3 细胞培养和转染

siFAM83H 与siFAM83H-AS1 干涉载体由上海基尔顿生物公司构建。A549、SKOV3 细胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基在37℃，5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞进行转染，分为空载对照组（siNC 组）和实验组（siFAM83H 组、siFAM83H-AS1组），同时设置空白对照组（control 组），细胞转染利用脂质体Lipofectamine 2000（美国Invitrogen 公司）介导的方法，转染48 h 后进行后续实验。本研究所有实验步骤均重复3 次。

1.4 Real-time PCR 实验

胰酶消化并收集各组细胞，Trizol 试剂盒提取总RNA，并对提取的RNA 进行浓度和纯度检测。在37℃60 min、85℃5 min、4℃5 min 的条件下，将RNA 逆转录合成cDNA。将合成的cDNA 按Real-time PCR 试剂盒说明书进行扩增，PCR 扩增：95℃10 min（95℃15 s，60℃45 s），40 个循环；
熔解曲线：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；
以GAPDH 作为内参，检测FAM83H、FAM83H-AS1 的表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot 检测

RIPA 法提取细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。上样后SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗室温孵育2 h，TBST 洗涤3 次，每次5 min，二抗（1∶1 000）37℃孵育1 h，TBST 洗涤3 次，每次5 min，ECL 系统显影（GAPDH 作内参）。

1.6 CCK-8 检测细胞增殖

胰酶消化细胞，镜下记数将细胞悬液浓度调整为3×104个/ml。按3×103个/孔，将细胞种至96 孔培养板，设置3 个复孔。在转染0、24、48、72 h 后，加入CCK-8 试剂，酶标仪检测细胞在450 nm 波长下的吸光度值。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

转染后的细胞用胰酶消化，计数后制备成1×106个/ml的细胞悬液，取1 ml 悬液离心收集细胞，Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，4℃避光孵育15 min后，加入碘化丙啶染色液，4℃避光孵育5 min 后，进行流式细胞仪检测。

1.8 Transwll 检测细胞迁移

胰酶消化细胞，用含1% FBS 的培养基制备3×105个/ml 的细胞悬液，每个Transwell 小室接种300 μl细胞悬液，下层加入700 μl 的含10% FBS 的培养基，每组细胞设置3 个复孔。培养24 h 后，取出小室，PBS 清洗2 次，甲醛固定10 min，PBS 洗涤2 次，0.5%结晶紫染色30 min，PBS 洗涤3 次，晾干后于显微镜下观察拍照（200×），计数不同视野下的细胞数取平均值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；
计数资料用百分率表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 FAM83H、FAM83H-AS1mRNA 在泛癌种水平的表达

GEPIA 在线工具分析结果显示，FAM83H mRNA在乳腺浸润癌、胸腺瘤、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鳞癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱尿路上皮癌、直肠癌、宫颈鳞癌和腺癌、子宫内膜癌和子宫肉瘤、卵巢浆液性囊腺瘤（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中表达上调；
在多形成性胶质细胞瘤、急性髓系白血病和皮肤黑色素瘤中表达下调。FAM83H-AS1 mRNA 在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞癌和腺癌、结肠癌、LUAD、肺鳞癌、OV、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、子宫内膜癌和子宫肉瘤中表达上调，在急性髓系白血病、皮肤黑色素瘤和睾丸癌中表达下调。见图1。

图1 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 在泛癌种水平的表达

2.2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表达与LUAD和OV 的预后

在LUAD 中，FAM83HmRNA 高表达组与低表达组生存曲线比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表达与LUAD 和OV 的预后

2.3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组FAM83H、FAM83H-AS1 表达比较

A549 和SKOV3 细胞中，siFAM83H 组FAM83H mRNA 及蛋白表达低于siNC 组（P＜0.05）；
siFAM83HAS1 组FAM83H-AS1 mRNA 表达低于siNC 组（P＜0.05）。见图3。

图3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组FAM83H、FAM83H-AS1 表达比较（n＝3）

2.4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组细胞增殖能力比较

A549 和SKOV3 细胞中，siFAM83H 组转染24、48、72 h 后细胞增殖能力低于siNC 组（P＜0.05）。siFAM83H-AS1 组转染24、48、72 h 后细胞增殖能力低于siNC 组（P＜0.05）。见图4。

图4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后细胞增殖能力比较（n＝3）

2.5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组细胞凋亡数量比较

A549 和SKOV3 细胞中，siFAM83H 组、siFAM83HAS1 组凋亡数量高于siNC 组（P＜0.05）。见图5。

图5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组流式结果

2.6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组细胞迁移数比较

A549 和SKOV3 细胞中，siFAM83H 组、siFAM83HAS1 组细胞迁移数低于siNC 组（P＜0.05）。见图6。

图6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各组Transwll 检测结果（结晶紫染色，200×）

2.7 FAM83H、FAM83H-AS1 表达的关联性

FAM83H 与FAM83H-AS1 以头对头（5’-5’）形式互补重叠，推测二者存在相互调控关系。A549 和SKOV3细胞中，FAM83H 后敲低，siFAM83H 组 与siNC 组siFAM83H-AS1 mRNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；
FAM83H-AS1 敲低后，siFAM83H-AS1 组 与siNC 组siFAM83HmRNA 和蛋白比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图7。尚不能认为FAM83H 与FAM83HAS1 之间存在调控关系。

图7 FAM83H、FAM83H-AS1 表达的关联性（n＝3）

本研究结果显示，FAM83H 和FAM83H-AS1 在多种肿瘤中上调，敲低FAM83H 或FAM83H-AS1 后，可抑制A549、SKOV3 细胞增殖和迁移，诱导细胞凋亡。提示二者在LUAD 和卵巢癌中具有癌基因的作用。

既往研究证实，FAM83H 基因在人类多种肿瘤中表达上调，且与不良预后相关，其机制涉及不同信号通路[11-13]。肝细胞癌中FAM83H 诱导细胞周期蛋白和基质金属蛋白酶-2 表达，癌基因MYC 结合到FAM83H 启动子区，促进其转录[2]；
胃癌中FAM83H 与Scrib 表达密切相关，FAM83H 和Scrib 可能通过稳定β-catenin 参与胃癌的进展[4]；
胰腺癌中FAM83H 过表达与CD8+T 细胞浸润减少及Ras-PI3K-mTOR 信号通路有关[5]；
FAM83H 在非小细胞肺癌组织中的表达增加，与患者的临床分期密切相关[14]。但FAM83H在卵巢癌中的表达尚未见报道，而本研究首次明确FAM83H 在LUAD 和卵巢中的生物学功能。

FAM83H-AS1 作为FAM83H 的天然反义转录本，其表达升高促进肿瘤发生发展[15-17]。FAM83H-AS1是LUAD 组织明显上调的长链非编码RNA 之一，FAM83H-AS1 通过调控Met/EGFR 信号，促进肺癌细胞增殖、侵袭和转移[18]；
FAM83H-AS1 还可以结合hnRNP K 以增强抗凋亡基因RAB8B 和RAB14 的翻译，从而抑制LUAD 凋亡[19]。FAM83H-AS1 在卵巢癌组织中高表达，其表达水平与巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等免疫细胞浸润程度相关，下调其表达可明显抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭[20-21]；
此外，FAM83HAS1 通过稳定HUR 蛋白参与卵巢癌的辐射抵抗和细胞转移[22]。本研究进一步证实FAM83H-AS1 在LUAD和卵巢癌中的生物学功能。

有研究报道，内源性反义长链非编码RNA 参与人类细胞基因表达的表观遗传调控[23]，其表达水平与宿主基因的表达水平呈正相关或负相关，提示编码和非编码转录本在特定的生物学途径中存在协同调节[24]。在食管癌中，FAM83H-AS1 与其正义链FAM83H在转录和翻译水平上存在一致性调节，FAM83H-AS1可能通过调控FAM83H 的表达而发挥癌基因作用[25]。尽管FAM83H 与FAM83H-AS1 在泛癌种水平的表达趋向一致，但是本研究未在细胞水平证实二者对彼此表达的影响，FAM83H 与FAM83H-AS1 可能独立发挥作用，具体机制仍待进一步研究。