BMP2基因远程调控元件的功能分析

万星琦，魏婉珍，郭胜良，崔一笑，景雪莹，黄露杰，马捷

研究快报

基因远程调控元件的功能分析

万星琦1，魏婉珍1，郭胜良1，崔一笑2，景雪莹1，黄露杰1，马捷1

1. 西安交通大学医学部基础医学院电镜室，西安 710061 2. 西安医学院口腔医学系，西安 710061

近年来数项基于遗传家系的研究表明，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)基因下游的远端增强子元件调控区域的异常重复是A2型短指(趾)症(brachydactyly type A2, BDA2)的致病原因，但是这段调控区域的确切分子功能尚不明确，甚至出现有相互矛盾的结果。本研究在生物信息学分析的基础上，通过PCR技术扩增了该调控区域的不同长度的目的片段，包括高度保守的2.1 kb核心序列和3个能够完全覆盖该2.1 kb片段的不同长度的截短体片段，进而构建基因重组载体，采用双荧光素酶报告基因检测方法对这些片段的生物学功能进行分析。结果发现，高度保守的2.1 kb片段并不具有增强子活性，而3个截短体片段均表现出强烈的增强子活性。这表明基因的表达调控模式非常复杂，对其下游的这段调控区域而言，选取不同长度的片段，其对表达调控的效果可能并不一致，这很可能是由于不同长度的片段所携带的调控元件数量或种类不同所致。此项研究初步揭示了基因调控元件的复杂性，为后续深入探究BDA2的分子致病机制提供了新的线索和方向。

BMP2；
增强子；
调控；
重复；
A2型短指(趾)症

短指(趾)症(brachydactyly，BD)是一类具有临床特征和相关基因异质性的疾病。BD的定义是由于指(趾)骨和(或)掌骨的异常发育而导致的手指(脚指)缩短，也可伴有其他手部畸形，如并指、多指、少指或指关节粘连[1]。其表现为单纯型或复杂综合征的一部分，单纯型BDs分为BDA-E，其中BDA又包含有A1，A2和A3三个亚型[2]。BD的不同类型具有某些重叠特征，包括指骨发育不全、缺损和指间关节形成异常，这表明指骨和关节的形成在发育和分子基础上是相互联系的，受一系列复杂的分子机制调控。

A2型短指(趾)症(BDA2，MIM112600)首先由Mohr和Wiredt在一个丹麦血统的挪威大家系中发现[3]。BDA2的患者表现为食指和(或)第二脚趾中指骨的偏斜和缩短，有时可累及第五指(趾)。目前已经发现，BDA2的致病基因具有较高异质性。除了已知的骨形态发生蛋白受体1b(bone morphogenetic protein receptor 1 b, BMPR1B)[4～6]和生长分化因子5 (growth differentiation factor 5, GDF5)[7～10]上发生的错义突变可致病以外，最近的四项研究相继发现骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)基因下游的一段调控序列的重复与疾病密切相关[11～14]。

BMP2属于BMP家族成员，是一种分泌型信号分子，参与包括模式形成和器官发育的许多发育过程。BMP2在胚胎发生过程中的作用已经被详细研究，例如：Lyons等[15]发现小鼠()中(人源的同源基因)在发育中的骨骼系统之外的多种胚胎上皮和间充质组织中表达，表明Bmp-2a在脊椎动物胚胎的形态发生和模式形成中发挥多种作用; Kulessa等[16]发现骨形态发生蛋白BMP家族成员是控制出生后毛囊毛干分化的遗传程序的关键调节因子; Pathi等[17]发现Bmp信号在软骨细胞的生长和分化中必不可少。总之，BMP2可在多个胚胎区域如肾脏、毛囊、牙芽和肠道上皮以及生长板的软骨肥大细胞、成骨软骨膜和成骨细胞中表达[15～17]。在指间关节发育期间，BMP2首先表达在未来关节周围的区域。在E14.5天的胎鼠中，BMP2在关节间隙区也有表达[10]。事实上，手指和脚趾的形态发生需要不同蛋白质与调控序列的正确结合，以及不同蛋白质之间的协调。的表达调控是复杂的，已经发现了的几个顺式调控元件，包括转录起始位点上游的两个启动子[18～20]，基因5′端的一个增强子和一个沉默子[21]，以及一个3′端的远程增强子[22](这也是A2型短指(趾)症相关的发生重复的调控区域)。据报道，小鼠中的转录可受位于启动子下游156.3 kb处的增强子区域调控，其非编码序列变异可能影响转录，从而导致骨量变化及骨质疏松[22,23]。此外，基因的大片段非编码区内的保守序列中，理论上可能存在更多的调控元件。

在对下游调控序列重复的功能研究中，Dathe等[11]使用在体系统来测试重复区域对基因表达的影响，结果发现4.5 kb的重复片段可以驱动重组的报告基因在四肢的表达，其表达模式几乎与内源性小鼠同源基因的表达完全重叠。他们推测，重复区域可导致BMP2表达增加，这使得BMP2在与GDF5竞争其共同受体BMPR1B时更为有利。而在Su等[12]的研究中，于骨肉瘤U-2OS和HeLa细胞系中使用体外荧光素酶报告系统来测试重复序列中一段高度保守的2.1 kb片段对基因表达的影响。结果发现在两种细胞系中2.1 kb片段的活性降低，表明这个2.1 kb片段可能对基因表达具有抑制作用，得出了与Dathe等[11]结果相反的结论。鉴于此，有必要开展进一步的研究工作来阐明远端调控序列重复的确切分子功能。因此，本研究采用生物信息学分析、基因表达载体构建、双荧光素酶报告基因等分析方法，对这段重复区域，特别是核心的2.1 kb区域的功能进行研究，以期深入阐明基因下游调控元件的远程调控机制，以及在BDA2中的分子致病机理。

此项研究获得西安交通大学医学部生物医学科研伦理委员会批准。

1.1 生物信息学分析

运用UCSC数据库(UCSC Browser, Human Assembly, Mar 2006(NCBI36/hg18); http://genome. ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)对基因下游调控区域的DNA序列信息进行分析。为准确定位目标区域在基因组中的位置信息，需与已报道文献中的序列信息相一致，本研究选择使用发布于2006年3月的人类基因组数据NCBI36/hg18版本。

1.2 细胞培养

使用常用的工具细胞系HEK293T作为宿主细胞，该细胞系购自中国科学院细胞库(货号GNHu17，RRID:CVCL_0063)。在Dulbecco改良的Eagle培养基和高糖培养基中培养(DMEM/HIGH GLUCOSE) (Hyclone, 美国)，其中补充有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。所有细胞均在保持5% CO2和37℃环境的孵箱中培养。

1.3 分子克隆

因本研究目的片段是潜在的增强子元件，选择pGL3-Promoter(Promega，美国)作为载体。通过PCR技术扩增基因下游调控区域的不同长度的目的片段，PCR试剂购自大连宝生生物公司。分别将目的片段克隆到pGL3-Promoter中，位于I (识别序列为GGTACC)和I (识别序列为CCCGGG)位点之间的萤火虫荧光素酶编码区下游。根据目的片段情况不同分别对重组子进行命名：-2.1 kb的目的片段为2.1 kb的调控区域核心保守序列；
-1，-2和-3的目的片段均为2.1 kb区域的截短体，三者组合可完全覆盖2.1 kb区域；
-Irrelevant的目的片段为2.1 kb下游非编码区域的无关序列；
-Exon的目的片段为外显子2的编码序列。后两者均作为阴性对照。目的片段的DNA序列最终经Sanger测序法鉴定，与UCSC的NCBI36/hg38参考序列一致。运用在线软件Primer 3(https://primer3.ut.ee/)设计PCR引物，引物信息见附表1。

1.4 细胞转染和双荧光素酶报告基因实验

根据双荧光素酶报告基因实验手册，使用pRL-TK载体进行共转染实验。HEK293T细胞转染前先在48孔板中培养24 h。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)分别将pGL3-Promotor的各个重组子与pRL-TK(360 ng：40 ng/孔)载体共转染到HEK293T细胞中。转染48 h后，收获细胞。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性检测使用Dual- Luciferase®Reporter Assay Kit(Promega，美国)在多功能酶标仪(Tecan，瑞士)上进行。相对荧光素酶活性计算为萤火虫与海肾荧光素酶活性的比率。

1.5 统计分析

数据显示使用平均值±SEM。所有实验均独立重复3次以上。通过Student’s检验或Mann-Whitney U检验评估组间的统计差异。采用SPSS18.0软件进行统计分析。0.05被认为具有统计学意义。

通过序列比对，结合文献报道，在基因下游110 kb处的Chr.20:6806129–6814044区域是BDA2致病变异所在区域。在已报道的研究中，所有的基因组重复均发生在该区域内。进一步的序列分析显示，此区域内存在一段约2.1 kb的高度保守序列，在人()、恒河猴()、小鼠和狗()等物种中高度保守，表明这段2.1kb的区域可能具有更重要的生物学功能。

为深入探究这段2.1 kb序列的功能，本研究设计的3个截短体-1，-2和-3对这段区域进行了全面覆盖(图1A)。经过经典的分子克隆系列实验，成功构建了不同目的片段的重组载体。对阳性克隆结果进行基因测序分析，所得结果在NCBI数据库中进行Gene Blast序列比对分析，结果显示各重组载体上的目的片段序列与数据库参考序列完全一致(图1B)。双荧光素酶报告基因检测结果显示：(1)与转染pGL3-Promotor空载体组相比，转染-1(0.0001)、-2(0.0001)和-3 (0.001)片段组的荧光素酶活性显著增高，表明-1、-2和-3的DNA片段均具有增强子活性。(2)与转染pGL3-Promotor空载体组相比，转染-2.1 kb片段组的荧光素酶活性无显著变化，表明-2.1 kb的DNA片段不具有增强子活性。(3)与转染pGL3-Promotor空载体组相比，转染-Irrelevant和-Exon片段组的荧光素酶活性无显著变化，表明这两个组的DNA片段同样不具有增强子活性(图1C)。为进一步分析增强子元件可能的特异性核心序列，将-1，-2和-3这3个具有增强子活性的DNA片段分别进行了序列比对，结果未发现具有较好保守性的特异性共享序列。

图1 BMP2基因及其下游远程调控元件相关实验结果

A:基因位于Chr.20:6696745-6708910处，其下游远程调控元件区域(Chr.20:6806129-6814044)距约110 kb。UCSC数据库信息展示了不同物种中调控元件区域的保守性(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，其中有一段2.1 kb的区域显示高度的保守性。B: 携带不同片段的重组载体的测序鉴定结果。C: 不同目的片段重组子的双荧光素酶报告基因检测结果，***代表0.001, ****代表0.0001。

Su等[12]的研究是采用体外荧光素酶报告系统在骨肉瘤U-2OS和HeLa细胞系中来测试重复序列中一段高度保守的2.1 kb片段对基因表达的影响，结果发现在两种细胞系中2.1 kb片段的活性降低，表明这个2.1 kb片段可能对基因表达具有抑制作用。而本研究中使用了常用的工具细胞系HEK293T作为宿主细胞，开展细胞转染和双荧光素酶报告基因实验，结果发现该2.1 kb片段并不具有增强子活性。这一结果与Su等[12]的研究基本一致，即：此高度保守的2.1 kb区域不能增强基因的表达。事实上，这里选择的2.1 kb保守序列与Su等[12]研究的片段是一致的。但就结果而言，依然存在一定的区别，即：Su等发现这段保守区域可以发挥沉默子的作用，但在本研究中并没能验证这一作用。这可能是由于本次使用的细胞系及限制性内切酶的不同所致。

近年来，来自不同人群的基于家系的四项研究均报道，基因下游的远程增强子区域发生的基因组片段重复是BDA2的致病原因。但是在两项研究中，对这段增强子区域的生物学功能的解析结果却貌似矛盾。本研究中，在基因下游的远程增强子区域中2.1 kb高度保守片段上选取了3个能够覆盖该高度保守区域的截短体片段，结果发现每个片段均表现出增强子活性，各自均可以独立促进的表达，这带来新的启示。通过仔细分析此前的研究，发现Dathe等[11]选取了下游增强子区域的小鼠同源的约4.5 kb的片段展开研究，发现其具有促进表达的作用，而Su等[12]选取了下游增强子区域中保守性程度最高的2.1 kb片段进行分析，发现其不具有增强子活性，甚至有抑制表达的作用。本研究明确了这个2.1 kb区域不具备增强子活性，而从中选取0.94 kb，0.96 kb和0.62 kb的截短体片段又均表现出增强子活性。在不考虑实验材料差异的条件下，综合上述发现，可以得到一个相对合理的解释，即：基因的表达调控模式非常复杂，对其下游的这段调控区域而言，选取不同长度的片段，其对表达调控的效果可能并不一致，甚至是相反的。而之所以会出现这种情况，很可能是由于不同长度的片段所携带的调控元件数量或种类不同所致。

目前已知，BMP2在动物体内的整体丢失会导致胚胎死亡，其在骨骼发育中起着核心作用，如软骨生成、软骨和骨发育、骨矿物质密度的形成和肢体形成等[24～26]。BMP2及其相关的BMP家族成员，均属于转化生长因子Beta(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员，而TGF-β超家族在在骨和关节发育、细胞增殖和分化过程中的关键作用已被广为报道。BDA2的致病基因，和均为该超家族成员，其中GDF5和BMP2为细胞外配体，而BMPR1B系跨膜受体。研究表明三者的突变或变异均可影响正常的BMP信号传导途径，最终导致BDA2的发生[27]。最后，在此项研究中，尚存在一定的不足。例如，采用体外研究方式，所取得的结果可能与在体的真实情况有所差异。其次，本研究解析了2.1 kb高度保守区域内不同片段的增强子活性，但没有对2.1 kb区域以外的区域展开分析，因此，对这段近6.0 kb的远程调控区域的分析尚不够细致。

综上所述，本研究对基因下游远程调控区域中高度保守的2.1 kb片段进行了细致的分析，揭示了基因调控元件的复杂多样性，为后续深入研究BDA2的分子致病机制提供了新的线索和方向。

附加材料见文章电子版www.chinagene.cn。

[1] Temtamy SA, Aglan MS. Brachydactyly., 2008, 3: 15.

[2] Temtamy SA, Mckusick VA. The genetics of hand malformations., 1978, 14(3): 1–619.

[3] Mohr OL eds. A New Type of Hereditary Brachyphalangy in Man. Wentworth Press, 2019, 5–64.

[4] Lehmann K, Seemann P, Boergermann J, Morin G, Reif S, Knaus P, Mundlos S. A novel R486Q mutation in BMPR1B resulting in either a brachydactyly type c/symphalangism- like phenotype or brachydactyly type A2.2006, 14(12): 1248–1254.

[5] Lehmann K, Seemann P, Stricker S, Sammar M, Meyer B, Suring K, Majewski F, Tinschert S, Grzeschik KH, Muller D, Knaus P, Nurnberg P, Mundlos S. Mutations in bone morphogenetic protein receptor 1B cause brachydactyly type A2., 2003, 100(21): 12277– 12282.

[6] Bednarek M, Trybus M, Kolanowska M, Koziej M, Kiec-Wilk B, Dobosz A, Kotlarek-Lysakowska M, Kubiak-Dydo A, Uzarowska-Gaska E, Starega-Roslan J, Gaj P, Gorzynska I, Serwan K, Swierniak M, Kot A, Jazdzewski K, Wojcicka A. BMPR1B gene in brachydactyly type 2-A family withR486W mutation and a disease phenotype., 2021, 9(3): e1594.

[7] Dawson K, Seeman P, Sebald E, King L, Edwards M, Williams JR, Mundlos S, Krakow D. GDF5 is a second locus for multiple-synostosis syndrome.2006, 78(4): 708–712.

[8] Kjaer KW, Eiberg H, Hansen L, van der Hagen CB, Rosendahl K, Tommerup N, Mundlos S. A mutation in the receptor binding site of GDF5 causes Mohr-Wriedt brachy­dactyly type A2.2006, 43(3): 225–231.

[9] Ploger F, Seemann P, Schmidt-Von KM, Lehmann K, Seidel J, Kjaer KW, Pohl J, Mundlos S. Brachydactyly type A2 associated with a defect in proGDF5 processing.2008, 17(9): 1222–1233.

[10] Seemann P, Schwappacher R, Kjaer KW, Krakow D, Lehmann K, Dawson K, Stricker S, Pohl J, Ploger F, Staub E, Nickel J, Sebald W, Knaus P, Mundlos S. Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2.2005, 115(9): 2373–2381.

[11] Dathe K, Kjaer KW, Brehm A, Meinecke P, Nurnberg P, Neto JC, Brunoni D, Tommerup N, Ott CE, Klopocki E, Seemann P, Mundlos S. Duplications involving a conserved regulatory element downstream ofare associated with brachydactyly type A2.2009, 84(4): 483–492.

[12] Su PQ, Ding HK, Huang DS, Zhou Y, Huang WJ, Zhong LY, Vyse TJ, Wang YM. A 4.6 kb genomic duplication on 20p12.2-12.3 is associated with brachydactyly type A2 in a chinese family.2011, 48(5): 312–316.

[13] Liu XD, Gao LH, Zhao A, Zhang R, Ji BH, Wang L, Zheng YL, Zeng BF, Valenzuela RK, He L, Ma J. Identification of duplication downstream ofin a chinese family with brachydactyly type A2 (BDA2).2014, 9(4): e94201.

[14] Wang WB, Jia YC, Zhang Z, Xu J, Zuo RT, Kang QL. A novel duplication downstream ofin a chinese family with brachydactyly type A2 (BDA2)., 2018, 642: 110–115.

[15] Lyons KM, Pelton RW, Hogan BL. Organogenesis and pattern formation in the mouse: RNA distribution patterns suggest a role for bone morphogenetic protein-2A (BMP-2A).1990, 109(4): 833–844.

[16] Kulessa H, Turk G, Hogan BL. Inhibition of BMP signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle.2000, 19(24): 6664–6674.

[17] Pathi S, Rutenberg JB, Johnson RL, Vortkamp A. Interaction of Ihh and BMP/Noggin signaling during cartilage differentiation.1999, 209(2): 239– 253.

[18] Feng JQ, Xing LP, Zhang JH, Zhao M, Horn D, Chan J, Boyce BF, Harris SE, Mundy GR, Chen D. NF-kappaB specifically activates BMP-2 gene expression in growth plate chondrocytesand in a chondrocyte cell line.2003, 278(31): 29130–29135.

[19] Feng JQ, Harris MA, Ghosh-Choudhury N, Feng M, Mundy GR, Harris SE. Structure and sequence of mouse bone morphogenetic protein-2 gene (BMP-2): comparison of the structures and promoter regions of BMP-2 and BMP-4 genes., 1994, 1218(2): 221– 224.

[20] Feng JQ, Chen D, Ghosh-Choudhury N, Esparza J, Mundy GR, Harris SE. Bone morphogenetic protein 2 transcripts in rapidly developing deer antler tissue contain an extended 5" non-coding region arising from a distal promoter., 1997, 1350(1): 47–52.

[21] Sugiura T. Cloning and functional characterization of the 5"-flanking region of the human bone morphogenetic protein-2 gene., 1999, 338 (Pt 2): 433–440.

[22] Chandler RL, Chandler KJ, Mcfarland KA, Mortlock DP.transcription in osteoblast progenitors is regulated by a distant 3" enhancer located 156.3 kilobases from the promoter.2007, 27(8): 2934–2951.

[23] Styrkarsdottir U, Cazier JB, Kong A, Rolfsson O, Larsen H, Bjarnadottir E, Johannsdottir VD, Sigurdardottir MS, Bagger Y, Christiansen C, Reynisdottir I, Grant SF, Jonasson K, Frigge ML, Gulcher JR, Sigurdsson G, Stefansson K. Linkage of osteoporosis to chromosome 20p12 and association to.2003, 1(3): E69.

[24] Tsuji K, Bandyopadhyay A, Harfe BD, Cox K, Kakar S, Gerstenfeld L, Einhorn T, Tabin CJ, Rosen V. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.2006, 38(12): 1424–1429.

[25] Long F, Ornitz DM. Development of the endochondral skeleton., 2013, 5(1): a8334.

[26] Bandyopadhyay A, Tsuji K, Cox K, Harfe BD, Rosen V, Tabin CJ. Genetic analysis of the roles of,, andin limb patterning and skeletogenesis.2006, 2(12): e216.

[27] Lv ZJ, Wang ZH, Lu SX, Liu PR, Tian J. Brachydactyly and the molecular mechanisms of digit formation., 2019, 41(12): 1073–1083.

吕赵劼, 王志浩, 卢淑娴, 刘沛蓉, 田静. 短指(趾)症及指(趾)骨发育的分子调控机制. 遗传, 2019, 41(12): 1073–1083.

Functional analysis of the long-range regulatory element ofgene

Xingqi Wan1, Wanzhen Wei1, Shengliang Guo1, Yixiao Cui2, Xueying Jing1, Lujie Huang1, Jie Ma1

Recently, several pedigree-based studies have shown that abnormal replication of an enhancer element regulatory region in the downstream of the bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene is the cause of brachydactyly type A2 (BDA2). However, the exact molecular function of this regulatory region is unclear, and even conflicting results have emerged. In this study, based on bioinformatics analysis, we amplified target fragments of different lengths in this regulatory region by PCR technology, including a highly conserved 2.1 kb core sequence and 3 fragments that can completely cover the core 2.1 kb fragment. Then, the gene recombination vectors were constructed, and the biological function of these fragments was analyzed by the dual-luciferase reporter gene technology system. We found that the highly conserved 2.1 kb fragment did not have enhancer activity, while all of three truncated fragments showed strong enhancer activity. The results suggest that the expression regulation mode of thegene is very complex. For the downstream regulatory region, selecting fragments of different lengths may have different effects on the regulation ofexpression, which may due to the fragments with different lengths carrying different regulatory elements in the number of types. In summary, this study revealed the complexity ofgene regulatory elements, and provided new clues and directions for the subsequent in-depth exploration of the molecular pathogenic mechanism of BDA2.

BMP2; enhancer; regulation; replication; brachydactyly type A2

2022-09-18;

2022-10-21;

2022-10-31

陕西省自然科学基础研究计划(编号：2022JM-440)；
国家自然科学基金(编号：31371298)资助[Supported by the Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China (No. 2022JM-440), and the National Natural Science Foundation of China (No. 31371298)]

万星琦，硕士研究生，专业方向：人类遗传与发育生物学。E-mail: 1061606776@qq.com

黄露杰，检验师，研究方向：人类遗传与发育生物学。E-mail: huanglujie307@163.com

马捷，教授，研究方向：人类遗传与发育生物学。E-mail: majie@xjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-304

(责任编委: 吴强)