中华绒螯蟹二龄早熟和晚熟品系选育第五代(G5)的生长性能和性腺发育评估

范陈伟，姜晓东，成永旭,3，吴旭干,3

(1.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；
2.上海海洋大学，农业农村部淡水种质资源重点实验室，上海 201306；
3.上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)俗称河蟹、大闸蟹，是我国重要的养殖经济蟹类之一，因含有矿物质元素、脂肪酸、氨基酸、核苷酸和胆固醇等多类营养物质而深受喜爱，具有较高的经济价值和食用价值[1,2]。上世纪80年代以来，河蟹人工育苗技术不断突破，其产业规模得以迅速扩大，经过二十多年的发展，河蟹养殖地区已遍布全国大多数省份[2]。至2020年，我国河蟹养殖总产量已近80万t，成为中国水产养殖行业发展最迅速、最具特色的水产品产业之一[1,3-4]。但由于我国河蟹种业的保护措施比较薄弱，很多地方的养殖户普遍用小规格河蟹亲本进行繁育，加上无序引种和苗种盲目放流，导致近年来河蟹种质退化，表现为河蟹一龄性早熟率高、商品蟹规格小等缺点，严重制约了河蟹养殖产业健康发展[5-8]。

选择育种是一种传统有效的新品种培育方法，通过对群体的反复选择淘汰、优中选优，培育出符合选育目标的优良个体[9,10]。中国在河蟹的良种培育工作上做出了一些成果，到目前为止，已经选育出多个新品种[11]。但是这些新品种仅从生长性能上进行选育，缺乏性腺发育以及营养品质的选育[12]，而且随着市场竞争的日益激烈及河蟹产业的飞速发展，现有品种远不能满足河蟹产业发展需求，因此传统育种方式有待改进。

本课题组以长江水系野生和养殖河蟹作为基础群体，通过群体选育的技术方法，并以河蟹生殖蜕壳时间及性腺发育速度作为主要选育指标，进行河蟹二龄早熟和二龄晚熟品系的选育研究，目前已选育至第五代[13]。早熟品系以长江水系多代池塘养殖的人工繁殖品系为亲本，具有规格较大、成熟时间提前的特点；
晚熟品系以长江水系野生品系为亲本，具有扣蟹早熟率低、成蟹规格大、成熟时间延迟的特点[12]。

自二龄早熟和二龄晚熟品系的选育工作开展以来，已在养殖性能[12,14-15]、经济效益[16]、免疫抗病性能[15,17]、形态特征[18]和营养品质[19-20]等方面对群体进行了选育评估。为评估两选育品系目标性状的最新选育进展，本研究从生长性能和性腺发育等方面对奇数年第五代在扣蟹和成蟹阶段的养殖效果进行比较，用于进一步开展中华绒螯蟹的种质资源评价和良种培育研究，为新品种的进一步推广提供数据支撑。

1.1 扣蟹阶段养殖实验

1.1.1 大眼幼体来源

本实验用二龄早熟(EM)、二龄晚熟(LM)和对照组(未选育普通养殖品系)大眼幼体均来自上海海洋大学如东河蟹遗传育种中心。两选育品系和对照组群体亲本于2018年11月取自常州市金坛水产站河蟹养殖基地，选择肢体健全、健康有活力的亲本蟹用于繁育。EM、LM品系以及对照组雌雄亲本的平均体质量见表1。将各组亲本分别放入3口条件相似的实验池塘(长×宽×水深为14 m×11 m×2 m)中，池内海水盐度为18‰左右，池塘四周设置防逃板。亲本进入池塘2 d后开始投喂冰鲜鱼，日投喂量为体质量的2%～5%，具体投喂量根据前一天的残饵和水温情况来调整。

表1 中华绒螯蟹EM、LM品系第五代及对照组繁殖亲本的数量和平均体质量

2019年1月中旬排干池水后，剔除每个池塘里的所有公蟹，同时检查池内母蟹的抱卵情况，各组母蟹的抱卵率均高于90%。随后在相似的室外条件下开展亲本越冬、挂笼和幼体培育等工作。待2019年5月将淡化后所得的大眼幼体运送至上海海洋大学崇明竖新基地，用于进一步的扣蟹室外网箱养殖实验。

1.1.2 扣蟹阶段养殖管理

实验设置12个面积相等的围隔(长×宽=7.8 m×7.8 m)作为养殖池塘，来比较三群体在扣蟹阶段的养殖性能差异。围隔四周设有双层防逃网，防逃网上缘设置25 cm高的PE塑料防逃围板。为保持实验组水质一致，围隔之间水体相互连通。每个围隔中间设1个6 m×4 m×0.7 m的水坑，水坑四周平台上种植水稻以净化水质。为了便于采样和回捕扣蟹，在水坑中用毛竹架设1个2 m×2 m×1 m的网箱，网片孔径为0.425 mm，网箱内外缝有30 cm高的防逃塑料板。每个网箱中放入约1 500只大眼幼体，每实验群体设4个平行网箱，网箱内放置伊乐藻(Elodeanuttallii)供幼蟹隐蔽和蜕壳。各网箱日投喂破碎料量为1～5 g，根据气候、水温和摄食情况进行适当调整。

河蟹在大眼幼体以及扣蟹阶段蜕壳频率高、成活率不稳定。为避免各网箱之间成活率差距悬殊，影响最终生长性能的比较，6月中旬将每个网箱内实验蟹的数量调整为400只(雌、雄各半)，并将网箱内的伊乐藻替换为水花生(Alternantheraphiloxeroides)，继续进行扣蟹阶段的养殖。每天17:00投喂配合饲料(浙江澳华饲料有限公司)，随着扣蟹的蜕壳和生长，饲料粒径也随之增长，粒径分别为1.2 mm、1.6 mm和1.8 mm，每天的投饲量为蟹总体质量的1%～6%。网箱中设有小型食台，每次投喂4 h后，观察并记录饲料残留情况，据此调整次日的投饲量。定期清理水花生，使其密度适中，防止其疯长造成缺氧和水质恶化而影响扣蟹摄食。每隔20天左右用聚维酮碘对养殖网箱消毒，根据水质进行定期换水，以保证水质符合扣蟹生长要求。

1.1.3 数据采集

调整密度前，将每个网箱里所有的实验蟹捞出，统计每个网箱内蟹的数量，并称重，据此计算大眼幼体至仔蟹阶段的最终平均体质量、成活率以及增重倍数。

调整密度后，每月15日随机从每个网箱里各采样200只扣蟹，用干毛巾轻轻擦拭蟹体表水分后，采用电子天平精确称量(精确到0.01 g)，准确记录每只扣蟹的性别和体质量，据此计算每个月的增重率(weight gain rate,WGR)，计算公式如下：

WGR=100%×(Wt-Wt-1)/Wt-1

式中，Wt和Wt-1分别为第t月和t-1月各组扣蟹的平均体质量(g)。

网箱养殖实验于11月20日结束。随后捞出全部扣蟹，统计每个网箱内存活的扣蟹数量，分别计算雌、雄扣蟹和早熟蟹的平均体质量。对捕获的所有正常扣蟹按体质量进行规格划分，雌雄各分为5个等级：<1.50 g、1.50～2.99 g、3.00～4.49 g、4.50～5.99，≥6.00 g，分别统计三个品系扣蟹各规格等级所占的比例。

1.2 成蟹阶段养殖实验

1.2.1 实验用蟹种来源

选用扣蟹养殖实验结束后所收获实验蟹用于进一步的成蟹养殖实验，养殖实验于2020年2-11月在上海海洋大学崇明基地的9个池塘中(长×宽=12 m×8 m)进行，每群体设置3个平行池塘。扣蟹经30 mg/L聚维酮碘溶液浸泡消毒0.5 h后随机放养于养殖池塘内，每个实验池塘放扣蟹100只，雌雄各半，初始密度约为1个/m2。EM品系雌雄扣蟹初始体重分别为(7.88±0.11) g和(8.31±0.06) g，LM品系雌雄扣蟹初始体重分别为(7.71±0.08) g和(8.13±0.03) g，对照组雌雄扣蟹初始体重分别为(7.67±0.04) g和(8.10±0.12) g。

1.2.2 养殖管理

扣蟹放养前用漂白粉(南通市高阳漂白粉有限公司)对实验池塘进行消毒和清塘处理，用量为每个池塘10 kg左右。消毒10～15 d后种植伊乐藻，便于实验蟹躲避和隐藏，株距为2 m，行距为2 m，并根据水草的生长情况与外界气候变化合理控制每个实验池塘水位。夏季高温期水位保持在1.0～1.2 m，初期主要种植伊乐藻，养殖后期再搭配水花生，根据情况及时割除过多的伊乐藻，防止河蟹夜间和阴雨天缺氧。为了调节水质及控制野杂鱼，分别于3月和5月在每个池塘中放养5尾鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和5尾鳜(Sinipercachuatsi)鱼种(长度为5～8 cm)。5-6月每个池塘投放10 kg左右螺蛳(Margaryamelanioides)作为补充饵料，同时起到清除残饵和净化水质的作用。当池塘水温升至12 ℃后开始投喂配合饲料(浙江澳华饲料公司)，每天下午5点左右投喂，投喂量为蟹体重的3%～5%。每个成蟹实验塘设置一个食台用于观察实验蟹当天吃食情况，根据水温和残饵及时调整投喂量。7月初开始晚上给每个实验池塘开启底部微孔增氧。定期检查每个成蟹塘的氨氮(<0.4 mg/L)、溶氧(>3 mg/L)、pH(7.0～9.0)以及亚硝酸盐(<0.15 mg/L)等水质指标。根据池塘水质情况，每半个月更换掉实验池塘30%～50%的养殖水体，保持实验池塘水质良好。

1.2.3 数据采集

自5月15日起，每隔60天左右用地笼网抓捕采样，每个池塘随机采集雌雄个体各15只以了解各品系河蟹的生长和发育情况，称重前用毛巾擦拭河蟹体表水分后用电子天平精确称重(精确到0.01 g)，据此计算各采样时间点河蟹的WGR。

自从7月25日起每隔20 d采样1次，每池塘随机采样30只个体，雌雄各半，分别统计各池塘内河蟹完成生殖蜕壳的个体比例，根据王武[1]的方法判断采样个体是否已经完成生殖蜕壳：雄体主要依据交接器是否突出和硬化、大螯绒毛覆盖面积和长度、壳是否为青色等来判断；
雌体主要依据腹脐形状、腹脐绒毛长度和壳的颜色等来判断[21]，据此计算生殖蜕壳率(puberty molting rate,%)。

为了比较三群体在成蟹养殖阶段的性腺发育速度，当观察到完成生殖蜕壳的比例达到80%后，雄体从10月5日起每隔20 d从各池塘内随机采集3只，雌体从9月5日起每隔30 d从各池塘内随机采集3只，擦去体表水分后精确称量体质量(精确到0.01 g)，随后解剖取出全部肝胰腺和性腺并称重(精确到0.01 g)，据此计算肝胰腺指数(hepatosomatic index,HSI)和性腺指数(gonadosomatic index,GSI)，计算公式如下：

HSI=WH/W×100%

GSI=WG/W×100%

式中：WH为肝胰腺重；
WG为性腺重；
W为对应的河蟹体重。

实验于11月20日停止，排干实验塘后，对最终捕获的所有成蟹按体重进行规格分级，雄蟹分为6级：<120.00 g、120.00～144.99 g、145.00～169.99 g、170.00～194.99 g、195.00～219.99 g和≥220.00 g；
雌蟹分为5级：<80.00 g、80.00～99.99 g、100.00～119.99 g、120.00～139.99 g和≥140.00 g，分别统计三群体成蟹各规格所占比例。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析，所有数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示。采用Levene法对所有数据进行方差齐性检验，当不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或平方根处理。采用ANOVA法对实验结果进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，取P<0.05为显著性差异。在GraphPad Prism软件上绘制相关图表。

2.1 扣蟹阶段养殖性能

2.1.1 大眼至仔蟹期间养殖性能

三群体在大眼幼体至仔蟹阶段的养殖性能如表2所示。各组仔蟹的平均体质量从小到大分别为对照组

表2 中华绒螯蟹二龄EM、LM品系选育第五代在大眼幼体至仔蟹阶段养殖性能

2.1.2 仔蟹至扣蟹阶段养殖性能

图1为选育品系第五代和对照组在扣蟹阶段体质量的变化情况。无论雌体还是雄体，三群体扣蟹平均体质量在6-11月份期间逐渐增加，并且三群体的平均体质量在6-11月份的差异情况始终为：对照组就雌体而言，各群体扣蟹平均体质量在整个生长期间均无显著差异。

图1 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在扣蟹阶段的平均体质量的变化情况

图2表明三群体雌雄扣蟹WGR均呈下降趋势。就雄体而言，LM品系扣蟹在7-8月和8-9月的WGR显著高于对照组，而在10-11月，各群体之间WGR互有显著差异，表现为LM品系显著高于对照组，对照组显著高于EM品系，其余时间段无显著差异。对雌体而言，LM扣蟹在7-8月和8-9月WGR显著高于对照组，且8-9月对照组WGR显著高于EM品系，其余时间段均无显著差异。

图2 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在扣蟹阶段WGR的变化情况

2.1.3 扣蟹规格分布

各群体扣蟹规格分布情况如图3所示，三群体规格百分比均呈正态分布。三群体扣蟹体质量主要集中于1.50～2.99 g、3.00～4.49 g和4.50～5.99 g这3个规格区间内，雄体中3种规格分别占各组扣蟹总数的69.03%、79.71%和84.98%，雌体中3种规格分别占各组扣蟹总数的73.38%、88.98%和80.38%。无论雄体还是雌体，对照组扣蟹在<1.49 g和1.50～2.99 g的规格范围内所占的比例均显著高于EM品系，EM品系雌雄扣蟹在4.50～5.99 g和≥6.00 g的规格范围内的占比显著高于对照组扣蟹，此外，LM雄体在≥6.00 g的规格区间内的占比显著高于对照组，其雌体在3.00～4.49 g的规格范围内的占比显著高于EM品系。

图3 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在扣蟹阶段规格分布的情况

2.2 成蟹养殖阶段的养殖性能

2.2.1 成蟹阶段的生长性能

两选育品系和对照组扣蟹在成蟹阶段的平均体质量变化如图4所示。无论雄体还是雌体，三群体平均体质量在成蟹养殖阶段均呈上升的趋势，并且三群体体质量在5-11月份的差异情况始终为：对照组

图4 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段平均体质量的变化情况

两选育品系和对照组扣蟹在成蟹阶段WGR变化如图5所示。无论雄体还是雌体，三群体WGR整体呈下降趋势。三群体雄蟹WGR在各时间段均无显著差异，雌蟹中二龄EM品系在5-7月的WGR显著高于对照组，且雌蟹中二龄EM品系在9-11月的WGR也明显高于其他两群体。

图5 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段WGR的变化情况

2.2.2 成蟹阶段的生殖蜕壳及性腺发育

随着实验的进行，三群体河蟹生殖蜕壳的完成比例呈上升趋势(图6)。三群体均从7月底8月初陆续开始进行生殖蜕壳，其中雄体生殖蜕壳的高峰期在8月15日-9月25日，雌体生殖蜕壳的高峰期在7月25日-9月5日，雌蟹生殖蜕壳完成的时间早于雄蟹。就雄体而言，8月15日EM品系生殖蜕壳率显著高于LM品系，10月15日EM品系和对照组均全部完成生殖蜕壳，而LM品系仍有个别未完成生殖蜕壳。就雌蟹而言，7月25日EM品系河蟹未发现完成生殖蜕壳的个体，LM品系和对照组的生殖蜕壳率在2%左右，8月15日LM品系生殖蜕壳率显著低于EM品系，此外9月5日三群体河蟹生殖蜕壳率均超过80%，到9月25日三群体基本完成生殖蜕壳。从整体上看，EM和LM品系成蟹的成熟时间较对照组各提前或推迟10-15天左右。其中，EM品系雄体在8月15日到9月5日的生殖蜕壳率从10.42%增到84.40%，而雌体在7月25日-8月15日从0增到59.52%，而同时期LM品系为4.44%～59.03%和2.22%～32.14%，对照组则为7.78%～72.02%和1.75%～38.91%。

图6 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段生殖蜕壳率的变化情况

三群体河蟹在性腺发育期间的GSI和 HSI变化情况如图7和图8所示。随着生殖蜕壳的完成，三群体雌雄个体GSI快速增加而HSI呈下降趋势。就GSI而言，三品系的GSI差异与生殖蜕壳率基本一致，EM品系雌雄成蟹的性腺发育较快，其GSI略高于对照组，而LM品系性腺发育较慢，其GSI略低于对照组；
二龄EM品系雄蟹10月25日的GSI显著高于LM品系，二者与对照组无明显差异。就HSI而言，LM品系雄蟹在10月25日的HSI显著高于EM品系，LM品系雌蟹在9月5日和10月5日的HSI明显高于EM品系，而对照组均居于中间，与两选育品系均无明显差异。

图7 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段GSI的变化情况

图8 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段HSI的变化情况

2.2.3 成蟹规格分布

三群体成蟹的最终规格分布如图9所示。雄蟹的体质量主要集中于120.00～144.99 g、145.00～169.99 g、170.00～194.99 g、195.00～219.99 g 4个规格区间内，分别占EM、LM和对照组成蟹总数的79.92%、83.56%和73.48%，雌蟹主要集中在80.00～99.99 g、100.00～119.99 g、120.00～139.99 g 3个规格区间内，分别占各组成蟹总数的76.78%、68.12%和73.16%。就雄蟹而言，三群体在各规格区间内均无显著差异，仅LM雌体大规格蟹(≥140 g)的规格区间里比例显著高于对照组。

图9 中华绒螯蟹EM和LM品系选育第五代在成蟹阶段规格分布的情况

甲壳类动物在体质量和增重率等与生长有关的性状上具有较高的遗传力，因此遗传选育可以有效提高甲壳动物生长性能[22]。本课题组2010年以二龄性成熟时间及生长性能为主要选育指标建立了两个独立的河蟹选育品系(分别为EM品系和LM品系)，经过多年选育至2019年已选育至第五代幼体培育阶段[12]。为评估两选育品系目标性状的选育效果，本实验将两选育品系大眼幼体在相似的网箱环境下从仔蟹养至扣蟹，随后挑选规格一致的两品系扣蟹在相似池塘条件下养殖至成蟹，并以未选育群体作为对照。经过整个生长周期的养殖，EM和LM品系在扣蟹阶段和成蟹阶段在生长性能方面与对照组相比均有一定的提升。之前的研究表明水产动物生长性能主要受收到放养密度、养殖环境、摄食饲料总量以及个体间的遗传差异的影响[23-25]。本实验中苗种放养密度、养殖环境以及养殖周期基本一致，因此本实验中不同品系河蟹的生长性能差异与品系自身遗传因素有关，为人工定向选育的结果[26-27]。

蔡强等[28]发现南美白对虾(Penaeusvannamei)选育子一代的平均规格和亩产量比对照组高32.85%和20.94%；
李建等[29]在对中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)的研究发现，经过连续6代的群体选育后，其子代的平均体质量比对照组高26.86%；
朱清顺等[30]发现中华绒螯蟹“苏蟹一号”在经过连续3代的群体遗传选育后平均规格比对照组高20.99%，成活率高约80%。本研究结果表明使用大规格河蟹作为亲本进行选育能有效提高后代的体质量和增重率等生长性状，并证实了前人在其他甲壳动物上的选育效果。

河蟹在整个生命周期中需经历多次蜕壳并伴随着生长及变态。河蟹在成蟹养殖阶段需蜕壳4～5次，处于性腺发育初期的河蟹逐渐开始进行生殖蜕壳，随后进入性腺快速发育阶段[31]。处于性腺发育阶段的河蟹头胸甲长度和宽度不再增大，仅储存营养物质并充实肌肉和内脏器官，为后续越冬及生殖作准备[32-33]。由于河蟹雌雄个体生殖系统存在巨大差异，其性腺发育规律也表现为性别二态性，往往雌体性腺发育早于雄体，上市时间也相应较早。在评估EM和LM品系G4选育效果时发现，EM品系雌雄个体在各采样时间点的生殖蜕壳率均高于对照组，且LM品系相对最低[13]，结果与本研究一致，说明经过多代群体选育后，其目标性状(早熟和晚熟)的选育效果已初见成效，并能世代稳定遗传，进一步表明以生殖蜕壳时间作为选育指标的可行性。

本实验中三群体雌雄成蟹的GSI随着时间的延长逐渐上升，HSI呈下降趋势，验证了河蟹性腺发育是将营养物质从肝胰腺转移至性腺中的过程[34]，二者呈负相关关系。而LM品系雌蟹HSI呈先升后降的变化趋势，可能是由于9月5日至10月5日期间EM品系及对照组肝胰腺中营养物质已逐渐向卵巢中转移，而LM品系河蟹由于成熟时间和性腺发育较晚，性腺中营养物质的积累也相应较晚[35]。不同于大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)体重和性成熟度之间的高度正相关关系，本研究中LM品系的生长性能与性腺发育速度呈明显的负相关，表明以生长性能作为指标开展选择育种可能会推迟甲壳动物的性腺发育，这可能是由于甲壳动物将更多能量转移至生长而不是性腺发育和繁殖[36]。

综上所述，通过5世代的连续定向选育，河蟹EM和LM品系在扣蟹和成蟹阶段生长性能均优于对照组，EM品系扣蟹和成蟹的最终体质量分别比对照组高1.34%～7.27%和6.74%～8.19%，LM品系分别比对照组高7.24%～22.31%和15.76%～16.00%，其中LM品系在生长性能方面的优势更为明显。在性腺发育方面，EM和LM品系成蟹成熟时间分别比对照组提前和推迟10天左右，性腺发育速度方面，EM品系在相同时间段内的GSI较对照组高8.96%～20.27%，其应用前景和市场广阔，是值得大规模推广的河蟹新品种。