米氏运脾化浊方治疗糖尿病合并脂肪肝实验研究*

柯婷 祁海燕 李婷 王高雷 杭程 王露露 师韩菲 董丹丹 肖洋

(陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

目前关于糖尿病合并脂肪肝的发病率逐年增加，我国2型糖尿病患者脂肪肝发病率高达67.9%[1]，胰岛素抵抗是两者共同作用机制[2-3]，机体胰岛素分泌异常，胰岛素敏感性降低，血浆脂蛋白清除能力下降，大量脂肪酸合成，从而形成脂肪肝[4-6]，脂质代谢紊乱则进一步影响胰岛素分泌，血糖调节功能障碍，两者相互影响，则成为心脑血管疾病、全因死亡风险共同作用因素。

有研究认为，胰岛β细胞为维持个体内血糖平稳，肝脏组织在胰岛素抵抗下，需分泌胰岛素代偿，从而导致高胰岛素血症，且需提高内固醇调控组件蛋白1-C(sterol regulatory element blinding protein-1c,SREBP-1c)、肝X受体(liver Xreceptors,LXR)的呈现。葡萄糖也可以通过激活转录因子碳水化合物反应原件结合蛋白(ChREBP)的表达，促进脂肪酸的生物合成，平衡体内脂肪生成基本表达的SREBP-1c升高脂肪酸合成作用，加速干细胞内脂肪储存[7-9]。LXR是新发现的一种肝脏内脂质调节因子，其可与SREBP-1c形成正反馈调节回路，参与调控肝脏内的脂质生成过程[10]。脂肪细胞分泌的脂联素可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶和过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)促进肝脏和肌肉内的脂肪酸氧化代谢过程，抑制肝脏糖异生和脂质生成作用。因此基于PPARa通路的糖尿病合并脂肪肝作用机制研究成为本病临床诊治的热点与重点。

现代医学关于此类疾病没有特效药物[11]，且治疗用药副作用较大、作用靶点单一等可导致治疗过程中存在诸多不足，从而引起一系列医疗资源的过度消耗、住院费用上涨、人们生活质量下降等。中医学关于糖尿病合并脂肪肝没有明确记载，分散于“消渴”“胁痛”“积聚”等内容，历代医院关于本病治疗确有一定疗效[12]。长安米氏内科流派路波主任医师在临床实践中，认为嗜食肥甘厚腻，燥热、湿浊内生，热炽胃肠、湿热困脾，久则痰瘀互结，遂研制运脾化浊方，疗效显著。故本研究制备糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，通过运脾化浊方与盐酸二甲双胍干预对照研究，阐述运脾化浊方对模型大鼠血糖、胰岛素及SREBP-1、ChREBP、PPARa和调节因子LXR表达机制。

1.1仪器 ACS电子秤(杭州万特衡器有限公司)；
Centrifuge5430离心机(德国艾本德公司)；
KD-BM包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；
OLYMPUS CK31正置光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；
MSX2成像系统(广州市明美光电技术有限公司)；
Champchemi 610 plus全自动化学/荧光/凝胶成像分析系统(北京赛智创业科技有限公司)；
GTR16-2低温高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)；
NMYA-60摇床(泰州诺米医疗科技有限公司)；
DW-86L338J -80 ℃度医用冰箱(深圳市科力易翔仪器设备有限公司)。

1.2试药 运脾化浊免煎制剂(药物组成为：黄连、黄芩、郁金、清半夏、干姜、党参、薤白、丹参、白芍、山楂等)：中药方由陕西省中医医院米氏内科内分泌二科提供，陕西省中医医院中药免煎制剂中心配制，1 剂/天，分早、晚 2次开水冲化后温服；
链脲佐菌素(北京金泰宏达生物科技有限公司，批号：S1030-100 mg)；
异丙醇(华北地区特种试剂开发中心)；
β-巯基乙醇(天津市光复精细化工有限公司)；
Ribonuclease inhibitor(货号D2310A,日本TaKaRa公司)；
dNTP Mixture(货号4019,日本TaKaRa公司)；
M-MLV Reverse Transeriptase(货号M1701,美国Promega公司)；
PowerUp SYBR Green Master mix(货号A25741,德国Qiagen公司)。DEPC水(货号R1600，北京索莱宝科技有限公司)、Oligo(dT)18 Primers(货号3806，日本TaKaRa公司)；
变性缓冲液(TRIZOL)(货号15596018，美国ThermoFisher Scientific公司)；
30%的丙烯酰胺制胶液(29∶1)(货号Cat#A1010，北京索莱宝科技有限公司)；
RIPA裂解液(货号P0013B，上海碧云天生物技术有限公司)；
TEMED(货号L19S10G98319，上海源叶生物科技有限公司)；
BSA(货号4240GR100，德国Biofroxx公司)；
TWEEN 20(货号1247ML500，德国Biofroxx公司)；
甘氨酸(货号Cat#G8200，北京索莱宝科技有限公司)；
Tris(货号1115GR500，德国Biofroxx公司)；
Ultra SYBR mixture(low rox)(货号CW2601H，康为世纪生物科技有限公司)；
Rabbit Anti-WBSCR14 antibody(货号bs-3516R，北京博奥森生物技术有限公司)；
SREBP-1 Polyclonal Antibody(货号414584，美国Signalway Antibody公司)；
PPAR-αPolyclonal Antibody(货号413594，美国Signalway Antibody公司)；
LXR-A Antibody(货号25041，美国Signalway Antibody公司)。

1.3实验动物 SPF级SD雄性大鼠33只(许可证号：NO1103222011002509)，约(100±20)g，购于北京华阜康。

2.1分组与给药 所有实验大鼠适应性喂养1 w后，按照随机数字表随机分为两组：除空白组予以生理盐水外，余组大鼠均予以高糖高脂(成分：10%蔗糖、10%蛋黄、10%猪油、1.5%胆固醇、0.5%胆盐和68%基础饲料混合)饲料喂养1月后，连续5 d给予STZ(40mg/kg/d，腹腔内注射)，7 d(即STZ 7 d)后，用血糖仪取尾静脉血测空腹血糖，以连续3 d大鼠空腹血糖值(FBG)高于11.1 mmol·L-1的大鼠作为造模成功标准。成模后继续给予高糖高脂饮食喂养1月，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。将造模成功的糖尿病大鼠随机分为4组，即：运脾化浊组、运脾化浊联合二甲双胍组、二甲双胍组、模型组，正常组每日予以生理盐水灌胃(1 mL/只)、运脾化浊组每日予以免煎中药灌胃(3 mL/只)、运脾化浊联合二甲双胍组灌胃(免煎中药：2 mL/只、二甲双胍：1 mL/只)、二甲双胍组灌胃(3 mL/只)。治疗8周结束后3 d处死大鼠，取全血或血清检测生化指标，取肝脏组织进行HE染色观察。

2.2饲养环境 饲养于干净实验室，环境温度为(21±3)℃，相对湿度为60%～80%，自然光照射。保持安静环境，自由饮水进食。

3.1一般情况比较 ①正常对照组：体重增加，健康活泼，毛发鲜亮光滑，食欲正常，无死亡情况；
②模型组：明显消瘦，反应迟钝，毛发粗糙，多饮多食多尿，死亡1只；
③运脾化浊联合二甲双胍组：体重无明显变化，然较正常对照组稍偏低，毛发整洁，精神状态尚可，食量尚可，大便颜色略偏深，无死亡情况；
④二甲双胍组：体重减轻，毛发欠光泽，精神一般，饮食尚可，多尿，大便颜色偏深，死亡1只；
⑤运脾化浊组：形体略偏瘦，毛发尚光泽，精神一般，食欲佳，大便颜色正常，无死亡情况。其中大鼠死亡情况考虑为灌胃不当所致。

3.2大鼠体重研究 各组大鼠体重比较有统计学差异，其中二甲双胍组较正常对照组大鼠体重减轻明显(P<0.01)，见表1。

表1 大鼠体重比较

3.3各组葡萄糖及胰岛素水平变化 各组大鼠血糖比较有统计学差异，其中正常对照组、运脾化浊联合二甲双胍组及运脾化浊组较模型组血糖水平均明显偏低(P<0.01)，正常对照组较运脾化浊联合二甲双胍组、二甲双胍组、运脾化浊组血糖水平均明显偏低(P<0.01)，运脾化浊组较二甲双胍组血糖水平有所偏低(P<0.05)。血清胰岛素各组比较无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血糖及胰岛素比较

3.4Western Blot法检测 将称取50 mg肝脏组织块置于1.5 mL的离心管中，加入RIPA裂解液150 μL，用干净剪刀将组织块尽量剪碎，用研磨器研磨；
研磨完毕再加入750 μL的RIPA裂解液，置于冰上裂解1 h。取出离心管上下混匀，放入低温高速离心机中4℃下12000 r·min-1离心20 min，离心后上清液，移至1.5 mL离心管中，并置于-80 ℃保存。用Bradford法进行蛋白定量测定，根据标准曲线计算出样品的浓度计算上样量，变性、电泳，再进行凝胶转膜检测。

各组大鼠ChREBP表达无统计学差异(P>0.05)，SREBP-1蛋白表达有统计学差异，其中正常对照组、二甲双胍组较模型组SREBP-1表达水平明显降低(P<0.01)，运脾化浊联合二甲双胍组较模型组SREBP-1表达水平略降低(P<0.05)。LXR表达有统计学差异，其中正常对照组、运脾化浊联合二甲双胍组较模型组LXR表达水平明显降低(P<0.01)，二甲双胍组较模型组LXR略降低，正常对照组较二甲双胍组及运脾化浊组相比LXR略降低(P<0.05)。PPARa表达有统计学差异，正常对照组较模型组比较PPARa表达水平明显升高(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠ChREBP、SREBP-1、LXR与PPARa比较

糖尿病合并脂肪肝目前是影响人类健康的主要代谢性疾病，是导致心血管事件发生，降低生活质量的后备患者人群。长期糖脂代谢紊乱与机体胰岛素抵抗密切相关。血糖升高，可产生高胰岛素血症，葡萄糖代谢和利用功能障碍，脂肪酸合成增加，可进一步导致肝脏脂质蓄积，肝细胞损害，在氧化应激条件下，对肝细胞则造成“二次打击”[13-14]，这是糖尿病合并脂肪肝核心发病基础，也是影响疾病迁延难愈的关键。

长安米氏内科流派在前期大量临床观察中，总结认为本病发病系胃肠燥热太过，脾不运化，脾虚痰盛，痰浊瘀阻，互结为病，故研制“运脾化浊方”[15-17]，可有效改善患者胰岛素抵抗及生化指标，减少内脏脂肪含量，临床疗效显著。本方以苦寒之黄连、黄芩、郁金三味药泻中焦胃热[18]，黄连分治三焦火邪，黄芩可清内郁之热邪，与黄连同用，清热功著。研究证实[19]，黄连有效成分可改善2型糖尿病小鼠的肝糖原结构，同时可降低血脂水平。黄芩苷能显著降低免疫性肝损的转氨酶，减轻肝细胞坏死[20]。郁金行气解郁、清心凉血，具有保肝降脂、抑菌抗炎功效[21]。半夏、干姜味辛散痰浊之郁结；
黄连与半夏同用可改善糖脂代谢[22]。干姜性热、味辛，具有抗氧化、抗病原体、保肝利胆、改善局部血液循环等多种作用[23]。党参、薏苡仁以健脾燥湿，杜生痰之源，可佐制黄连苦寒败胃之弊，党参可降低血糖、抑制醛糖还原酶活性，降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇，提高高密度脂蛋白胆固醇含量[24]。有学者发现[25]，薏苡仁多糖具有降糖作用，效果与浓度呈正相关，且可改善脂质代谢异常。配山楂酸甘之品消积祛瘀化痰，可调节机体脂质代谢，降低血糖，降低胰岛素抵抗指数[26]；
丹参、川芎、三七等行气活血化瘀，其中丹参有效成分是脂溶性的化合物，具有扩张血管、保护血管内皮细胞，抗动脉粥样硬化，保护肝细胞和抗纤维化[27]。川芎辛香温燥，走而不守，为血中之气药，可保护脏器细胞、抗氧化、抗动脉粥样硬化等[28]。三七具有降血脂、抗氧化、抗焦虑和免疫调节等作用[29]。本方合中药性味辛、苦、酸以达开郁运脾、清泻郁热、酸化阴精、化痰活血之功。

本实验建立糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，经研究观察，模型组大鼠明显消瘦，多饮多食多尿。盐酸二甲双胍组体重减轻，饮食一般，多尿，大便颜色偏深。而运脾化浊单组和与盐酸二甲双胍连用组较模型组大鼠体重无明显变化，大鼠毛发整洁，食量尚可，无死亡情况。与模型组相比，正常对照组、运脾化浊联合二甲双胍组及运脾化浊组血糖均显著下降，运脾化浊组较盐酸二甲双胍组下降明显。血清胰岛素各组无明显差别。各组ChREBP无明显差异。运脾化浊联合二甲双胍组及盐酸二甲双胍组SREBP-1较模型组有所降低，运脾化浊联合二甲双胍组及盐酸二甲双胍组LXR较模型组下降。由此可知，运脾化浊颗粒在改善糖尿病合并脂肪肝模型大鼠一般状况、降糖及降低促进胰岛素抵抗的蛋白水平方面具有一定优势，为进一步研究蛋白质代谢组学技术、基因测序等提供有力的研究基础。