白花丹素对涎腺腺样囊性癌细胞增殖、迁移、凋亡的干预作用及其机制

孙银雪，岳海云，葛可欣，张东升

1 山东中医药大学第一临床医学院，济南 250013；
2 解放军第九六〇医院基础医学实验室；
3 山东第一医科大学附属省立医院口腔颌面外科

腺样囊性癌（ACC）约占唾液腺肿瘤的10%，通常生长缓慢，但术后局部复发和远处转移的发生率较高［1］。ACC 根据组织学形态可分为实性、腺样或管状型，实体型通常分化较差，更具有侵袭性［2］。ACC 的治疗首选手术切除，但临床上局部复发和远处转移仍较常见，通常辅以术后放化疗。但ACC 对传统化疗敏感性不高，且毒性反应较重，因此，寻找新的治疗药物对改善ACC 的疗效具有重要意义。白花丹素（PLB）是从白花丹根叶中提取的天然萘醌衍生物［3］，具有抗炎、抗微生物、调节血脂及抗肿瘤的生物学效应［4-5］。研究发现，PLB 在多种肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用，包括乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、脑胶质瘤和视网膜母细胞瘤等［5-7］。PLB 主要通过抗增殖、抗血管生成、抗侵袭和转移、细胞周期停滞以及诱导肿瘤细胞自噬和凋亡等发挥抗肿瘤效应［3，6-7］。但是PLB 对ACC 的作用及机制目前尚未阐明。2021 年5 月—2022 年10 月，我们观察了不同浓度PLB 对ACC 细胞增殖、迁移和凋亡的干预作用，并探讨其作用机制与线粒体氧化应激的关系。

1.1 材料 人涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83（吉妮欧生物，广州）。白花丹素（Sigma-Aldrich，上海）；
胎牛血清（四季青，浙江）；
DMEM（Gibco，美国）；
青—链霉素、结晶紫染色液、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒、DCF-DA 染色试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、TMRE 试剂盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、HRP 标记的二抗、超敏ECL 化学发光试剂盒（碧云天，上海）；
TUNEL 染色试剂盒（罗氏，美国）；
GAPDH、bcl-2、bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 抗体（万类生物，沈阳）。二氧化碳培养箱（Thermo Fisher，美国）；
酶标仪（Thermo Fisher，美国）；
高速离心机（Thermo Fisher，美国）。

1.2 细胞培养 取SACC-83 细胞，加入含10%胎牛血清、1%青—链霉素的DMEM 培养基，置于5% CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中培养。当细胞融合度达到80%，按照1∶2传代。

1.3 细胞分组与给药处理 取对数生长期细胞，分为0、12.5、25、50 μmol/L PLB 组，分别加入含0、12.5、25、50 μmol/L PLB的DMSO培养基，培养24 h。

1.4 细胞毒性检测 采用LDH 释放法。取各组细胞培养上清10 μL，加入LDH 反应液孵育30 min，在酶标仪上测量450 nm处光密度（OD）值。加入RIPA裂解细胞，离心取上清，测量450 nm 处总吸光度B。LDH 释放量=A/B×100%。以细胞培养上清中LDH含量表示PLB对SACC-83的细胞毒性作用。

1.5 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法，取各组细胞，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h。在酶标仪上测量450 nm处的OD值。

1.6 细胞迁移能力观察 采用Transwell 实验。取各组细胞，加入胰酶消化，调整细胞密度至5×104/mL，每个小室内加入细胞悬液100 μL。在24 孔板下室加入600 μL 含20% FBS 的培养基，共同培养24 h。迁移细胞使用4%多聚甲醛固定，1%结晶紫染色15 min，显微镜下拍照并计数。

1.7 细胞凋亡检测 采用TUNEL 染色法。取各组细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃下与TUNEL 反应混合物孵育1 h，DAPI 复染15 min。荧光显微镜下随机选取5 个视野，计数总细胞数和阳性细胞数，细胞凋亡率=TUNEL 阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8 细胞氧化水平检测 采用荧光探针DCF-DA检测活性氧（ROS）水平。将细胞以1×104/孔接种在96 孔板中，37 ℃避光条件下与10 mmol/L DCF-DA孵育30 min，使用荧光酶标仪测量荧光强度（激发波长490 nm，发射波长530 nm）。采用微量法检测MDA 含量。取各组细胞，裂解并进行蛋白定量后，加入MDA 工作溶液，100 ℃加热15 min；
4 ℃下1 000 r/mim 离心10 min，收集上清。在酶标仪上测量532 nm处吸光度值。

1.9 线粒体膜电位检测 采用荧光探针法。将细胞以1×104/孔接种在96 孔板中，37 ℃避光条件下与1 μmol/L TMRE试剂孵育30 min，使用荧光酶标仪测量荧光强度（激发波长为540 nm，发射波长为595 nm）。1.10 凋亡相关蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，裂解并蛋白定量后，进行SDSPAGE 凝胶电泳并转移到PVDF 膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别与GAPDH（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase-3/Cleaved Caspase-3（1∶500）一抗，4 ℃孵育过夜。加入HRP 标记的二抗（1∶5 000）孵育1 h，使用ECL化学发光检测目标条带强度，Image J 软件进行灰度分析，计算抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的相对表达量，结果以Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3/Caspase-3表示。

2.1 各组细胞毒性比较 对照组以及12.5、25、50 μmol/L PLB 组细胞LDH 释放量（OD 值）分别为0.073 ± 0.001、0.129 ± 0.005、0.410 ± 0.038、0.461 ± 0.030，PLB不同浓度组LDH释放量均高于对照组，其中25、50 μmol/L PLB组高于12.5 μmol/L PLB组，50 μmol/L PLB组高于25 μmol/L PLB组（P均＜0.05）。

2.2 各组细胞增殖能力比较 对照组以及12.5、25、50 μmol/L PLB组细胞增殖OD值分别为0.610 ± 0.026、0.529 ± 0.027、0.125 ± 0.026、0.108 ± 0.003，PLB 不同浓度组细胞增殖能力均较对照组下降，其中25、50 μmol/L PLB 组低于12.5 μmol/L PLB 组（P均＜0.05），25 μmol/L PLB 组与50 μmol/L PLB组比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.3 各组细胞迁移能力比较 对照组以及12.5、25、50 μmol/L PLB 组细胞迁移率分别为100.0% ± 4.5%、83.5% ± 5.7%、64.2% ± 10.1%、54.2% ± 3.5%，PLB 不同浓度组细胞迁移率均低于对照组，其中25、50 μmol/L PLB 组低于12.5 μmol/L PLB 组（P均＜0.05），25 μmol/L PLB组与50 μmol/L PLB组比较无统计学差异（P＞0.05）。

2.4 各组细胞凋亡情况比较 对照组以及12.5、25、50 μmol/L PLB 组细胞凋亡率分别为5.6% ± 0.1%、22.0% ± 0.1%、52.1% ± 13.4%、70.1% ± 1.3%，PLB不同浓度组细胞凋亡率均高于对照组，其中25、50 μmol/L PLB 组高于12.5 μmol/L PLB 组，50 μmol/L PLB组高于25 μmol/L PLB组（P均＜0.05）。

2.5 各组细胞氧化水平比较 25、50 μmol/L PLB组细胞内ROS 水平均高于对照组和12.5 μmol/L PLB 组，其中50 μmol/L PLB 组高于25 μmol/L PLB组（P均＜0.05）。25、50 μmol/L PLB 组细胞内MDA水平均高于对照组，其中50 μmol/L PLB 组高于12.5、25 μmol/L PLB 组（P均＜0.05）。其他两两比较均无统计学差异（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组细胞ROS、MDA水平比较

表1 各组细胞ROS、MDA水平比较

注：与对照组比较，*P＜0.05；
与12.5 μmol/L PLB 组比较，#P＜0.05；
与25 μmol/L PLB组比较，△P＜0.05。

组别对照组12.5 μmol/L PLB组25 μmol/L PLB组50 μmol/L PLB组ROS 719 ± 220 1 040 ± 247 4 813 ± 562*#6 690 ± 919*#△MDA 0.229 ± 0.031 0.504 ± 0.076 0.841 ± 0.257*1.337 ± 0.397*#△

2.6 各组细胞线粒体膜电位比较 对照组和12.5、25、50 μmol/L PLB 组细胞线粒体膜电位荧光强度分别为433 ± 84、351 ± 148、223 ± 18、166 ± 6，其中25、50 μmol/L PLB 组线粒体膜电位低于对照组，50 μmol/L PLB 组细胞线粒体膜电位低于12.5 μmol/L PLB 组（P均＜0.05），其他两两比较均无统计学差异（P均＞0.05）。

2.7 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较 PLB不同浓度组Bcl-2/Bax 均低于对照组，Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于对照组（P均＜0.05），12.5、25、50 μmol/L PLB 组间两两比较均无统计学差异（P均＞0.05）。见表2。

表2 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较（ s）

表2 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较（ s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组12.5 μmol/L PLB组25 μmol/L PLB组50 μmol/L PLB组Bcl-2/Bax 12.030 ± 1.724 0.419 ± 0.115*0.490 ± 0.055*0.021 ± 0.008*Cleaved Caspase-3/Caspase-3 0.305 ± 0.022 1.198 ± 0.074*1.475 ± 0.253*1.798 ± 0.174*

植物中含有的一些天然活性产物可以抑制肿瘤细胞生物合成和有丝分裂，具有作为抗肿瘤药物开发的巨大潜力，已经用于治疗恶性肿瘤的如长春新碱、紫杉醇等［8］。随着基因编辑技术的快速发展，人们通过基因修饰促进天然药物活性物质积累，甚至生产异源重组蛋白，进一步拓宽了植物来源抗肿瘤药物的开发潜力。PLB是从中药白花丹的根系中分离的一种天然萘醌化合物［9］，可调控NF-κB、AKT、MMP-9、VEGF、STAT3、MAPK 等多种信号通路发挥抗肿瘤活性［3，10-12］，包括诱导DNA 和线粒体损伤［13］、凋 亡［6，14］和 自噬［12］、细 胞 周 期 停滞［14］、抗 血管 生成［11，15］和肿瘤转移［15］等。研究表明，在乳腺癌MCF-7 细胞中，PLB 可诱导ROS 生成及线粒体膜电位降低，导致细胞凋亡［6］；
在胰腺癌细胞中，PLB 可通过损伤线粒体诱导应激信号，并通过激活内在凋亡信号诱导ROS 介导的细胞凋亡［16］；
在人舌鳞癌SCC25细胞中，PLB可激活死亡受体介导的凋亡通路，抑制肿瘤细胞增殖［14］。然而，PLB 在涎腺腺样囊性癌SACC-83 细胞中的抗肿瘤作用和机制还未见报道。本研究结果显示，不同浓度PLB 培养SACC-83 细胞24 h后，细胞LDH释放量均高于对照组，PLB浓度越高，LDH 释放量越高，提示PLB 对腺样囊性癌细胞具有细胞毒作用。不同浓度PLB 培养细胞24 h 后，细胞的增殖和迁移能力均降低，凋亡率均升高，其中25和50 μmol/L PLB组的效果明显强于12.5 μmol/L PLB 组。此外，不同浓度PLB 组细胞Bcl-2/Bax 均低于对照组，而Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于对照组，提示抗凋亡信号减弱、促凋亡信号增强。因此认为，PLB 可有效抑制腺样囊性癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。

凋亡作为一种常见的程序性细胞死亡形式，可能是PLB发挥抗涎腺腺样囊性癌增殖和迁移的重要机制。线粒体作为一种古老的细胞器，不仅通过多种代谢模式为生命提供动力，在细胞凋亡过程中也具有至关重要的作用［17-18］。在诱导线粒体凋亡时，线粒体外膜通透性增加可导致细胞死亡，其下游的凋亡信号通路涉及线粒体释放的细胞色素C和随后的Caspase活化［19］。因此，针对线粒体外膜通透性从而调控细胞死亡具有巨大的治疗潜力。本研究结果显示，25、50 μmol/L PLB 组相比12.5 μmol/L PLB组和对照组具有更高的ROS和MDA水平，提示中高浓度PLB可促进腺样囊性癌细胞的氧化应激。与对照组相比，25、50 μmol/L PLB 处理24 h 后，细胞线粒体膜电位显著降低，提示PLB 可能促进腺样囊性癌细胞线粒体应激介导的ROS 生成，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和迁移。此外，线粒体在其他形式的程序性细胞死亡，包括坏死、铁死亡和焦亡中可能也具有重要的作用［17］，提示PLB 可能存在基于线粒体调控细胞死亡的新的途径，这将成为我们下一步的研究重点。

综上所述，PLB 通过诱导线粒体应激以及ROS介导的细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，可促进脂质过氧化和线粒体膜电位降低，激活凋亡相关信号通路，促进肿瘤细胞凋亡。PLB有望被开发为治疗包括腺样囊性癌在内的多种肿瘤的天然活性药物。尽管PLB具有广泛的抗肿瘤活性，然而其用作抗肿瘤药物仍存在一些困难：PLB作为天然活性物质，其本身存在水溶性差、生物利用度低的问题；
PLB对动物具有中等毒性，作为抗肿瘤药物其安全性仍有待研究［20］。目前，研究者们已经开始着眼于研究和解决PLB 转化所面临的困难，针对PLB生物利用度低的问题，有报道纳米封装可以提高PLB 的生物利用度，且不会削弱其抗肿瘤活性［21］。针对PLB 的生物毒性，有文献报道小鼠口服或腹腔注射PLB引起毒副作用的毒性剂量分别为8～65 mg/kg 和16 mg/kg［11］，已经远远超过其发挥抗肿瘤作用的生物效应剂量。然而BELLO 等［22］研究表明，口服2.5 mg/kg PLB 即可诱导线粒体依赖性睾丸细胞死亡，导致精子数量和活力下降。因此，PLB 可能并不适用于具有生育需求的肿瘤患者。尽管PLB 展现出优秀的潜在应用前景，我们仍需对其效应机制、毒性和安全性进行更全面和深入的研究。