lnc-NONHSAT074080调控靶基因ARL6IP4参与RA-UIP发病的机制研究

刘媛，鲁芙爱，王乐，杨有国，李小芬，肖运平

类风湿关节炎（RA）是一种以关节侵蚀破坏为主要特征的系统性自身免疫病，间质性肺疾病（ILD）是RA最常见的系统受累表现，也是导致RA患者死亡的主要原因［1］。普通型间质性肺炎（UIP）是RAILD 常见的病理类型之一，以肺组织结构明显破坏和广泛纤维化为特征，与特发性肺纤维化的表现和预后相似，是RA-ILD预后较差的病理类型［2］。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，参与细胞分化、免疫调控、组织纤维化等重要的生物学功能，从多层面调控基因的表达，参与疾病发生发展，为近年来的研究热点。lncRNA的表达或功能障碍与遗传性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤密切相关［3-4］。lncRNA 在多种纤维化组织中存在特异性的表达谱，被认为是纤维化的功能调节器，某些差异表达的lncRNA 在肺纤维化的发生发展中发挥重要的调控功能［5］。然而，lncRNA 在RA-UIP发病中的具体作用及机制尚不清楚。本研究通过基因芯片筛选RA-UIP 患者全血中表达上调的lncRNA，并采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测验证，同时从细胞水平验证目标lncRNA与肺纤维化的关系，在肺纤维化进程中的作用及调控的靶基因，探讨其在RA-UIP发病中的作用。

1.1 研究对象及分组 选取2019年1—12月就诊于包头医学院第一附属医院的RA 患者8 例，按是否合并UIP 分为RA肺纤维化组（4例），平均（59．25±1．26）岁；
RA对照组（4例），平均（59．75±0．96）岁，2组年龄差异无统计学意义（t=0．298，P＞0．05），男女比例均为1∶3。纳入标准：（1）RA 诊断满足2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟提出的RA 分类标准。（2）合并UIP 的患者满足2011 美国胸科学会和欧洲呼吸学会提出的UIP 分级诊断标准。排除标准：（1）有慢性疾病史。（2）合并其他结缔组织病。（3）非初次治疗的RA。（4）合并除肺脏外的其他重要脏器系统损害。（5）行肺组织活检。本研究通过包头医学院伦理委员会审批并获得研究对象知情同意。

1.2 材料 RNA 提取试剂盒购自德国Qiagen 公司；
体外转录试剂盒购自美国Ambion 公司；
基因片段和标记试剂盒购自美国Affymetrix 公司；
SYBR Green 荧光定量反转录试剂盒购自日本TAKARA 公司；
人肾上皮细胞系（293T）购自美国ATCC；
人胚肺成纤维细胞购自中国科学院细胞库；
DMEM培养基、胎牛血清、细胞冻存液及胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）购自美国Gibico；
Lipofectamine 2000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司；
转化生长因子（TGF）-β1 重组蛋白购自美国Selleck 公司；
CCK-8 试剂盒购自广州赛国生物科技有限公司；
小鼠抗人α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗及羊抗鼠二抗购自美国Sigma-Aldrich 公司；
Affymetrix Clariom D 基因芯片检测和引物设计委托南宁友田生物科技有限公司；
lnc-NONHSAT074080短发卡RNA（shRNA）慢病毒载体构建由南京临度医疗科技有限公司构建；
Ⅰ型胶原和纤连蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自厦门仑昌硕生物科技有限公司。Affymetrix杂交炉、GeneChip Scanner 3000激光扫描仪和Affymetrix Fluidics Station 450 洗脱站均购自美国Affymetrix公司；
qPCR仪7500购自美国ABI公司；
二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；
低温冷冻离心机购自德国HERMLE公司；
酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；
流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 Affymetrix Clariom D 基因芯片检测差异基因及生物信息学分析 在确诊后未开始治疗前，收集研究对象的全血样本3 mL。提取全血总RNA 并质检（保证RNA 的起始质量浓度达到17 mg/L，且RNA无明显降解和样本污染）。取质检合格的250 ng 总RNA 用配套的体外转录试剂盒制备生物素标记的cDNA 样品，将5．5 μg cDNA 样品于杂交炉中45 ℃条件下滚动杂交16 h，Affymetrix Fluidics Station 450 将芯片进行洗脱、染色后采用GeneChip Scanner 3000 扫描仪进行扫描，然后由Affymetrix GeneChip Command Console（AGCC）读取其数据，采用Gene Spring软件（安捷伦科技有限公司）进行生物信息学分析。

1.3.2 qPCR检测上调lncRNA的表达 选取2组基因芯片比较分析中基因表达差异倍数＞2的10个lncRNA，设计特异性引物，引物序列见表1。采用Trizol-RNA 提取试剂盒提取患者全血中的总RNA，反转录为cDNA，以此为模板采用SYBR Green 相对定量法进行qPCR 验证，反应条件：95 ℃预变性2 min；
95 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃15 s，共40 个循环。选择qPCR 验证后，RA 肺纤维化组lncRNA 的表达高于RA 对照组，且在生物信息学分析中发现的与肺纤维化进程相关的lncRNA进行后续实验。

1.3.3 荧光素酶标记实验 将lnc-NONHSAT074080结合序列克隆到表达载体pcDNA3．1 上，构建表达质粒；
靶基因ARL6IP4 的mRNA 3"-UTR 的片段插入到报告载体psiCHECK2，构建报告质粒。将空载体、lnc-NONHSAT074080表达质粒和ARL6IP4报告质粒转染人肾上皮细胞系细胞，分为空载体对照组、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 负对照组，pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2 组及pCDNA3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2组。各组细胞培养48 h后，收集细胞加入细胞裂解液，按照荧光素酶检测试剂盒的操作说明分别加入各检测试剂，使用酶标仪读取各组细胞海肾和萤火虫荧光强度，以海肾荧光值作为内参，计算各组细胞荧光素酶活性的比值。

Tab.1 Primer sequence of lncRNA表1 长链非编码RNA的引物序列

1.3.4 人胚肺成纤维细胞的培养及处理 人胚肺成纤维细胞系复苏培养后以3×106个/mL的密度接种于培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后换液，除去未贴壁的细胞及细胞碎片，每2～3 d换液1次。待细胞汇合成片后，传代及鉴定。

1.3.5 lnc-NONHSAT074080 shRNA 质粒载体的构建及细胞转染 针对NONHSAT074080 基因的cDNA 序列设计shRNA，并构建NONHSAT074080 shRNA慢病毒载体，转染人胚肺成纤维细胞，荧光显微镜鉴定转染效率，qPCR 检测NONHSAT074080 的基因表达。lnc-NONHSAT074080 shRNA 转染效率和沉默效果验证后，将人胚肺成纤维细胞分为空白对照组（未处理）、TGF-β1 组（细胞饥饿24 h，给予5 μg/L TGF-β1）、TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组（5 μg/L TGF-β1处理后给予lnc-NONHSAT074080 shRNA转染48 h），收集细胞及上清液。

1.3.6 CCK-8 法检测细胞增殖能力 将人胚肺成纤维细胞以3×103个/孔的密度接种在96 孔板中，每孔100 μL，每组3个复孔，置于常规培养箱孵育，细胞融合度达80%时，根据1.3.5分组进行干预，在干预0、24、48、72及96 h后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂后继续孵育细胞2 h，在450 nm 波长处测定其光密度值，检测不同时间点人胚肺成纤维细胞增殖水平。

1.3.7 细胞免疫荧光检测α-SMA的表达 将人胚肺成纤维细胞以1×104个/孔密度转移至6 孔板制成细胞爬片，当细胞生长密度达到约50%时，除去培养基，磷酸盐缓冲液清洗后加入1 mL 预冷的95%乙醇置于-20 ℃固定；
吸除乙醇，每孔加入1 mL 5%胎牛血清蛋室温封闭20 min；
加α-SMA一抗室温孵育60 min；
PBS 清洗后加入含标记的羊抗小鼠二抗，5%BSA-PBS室温避光孵育2 h；
PBS清洗3次；
避光环境下加入适量6-联脒-2"-苯基吲哚（DAPI）染色1 min；
甘油封片，共聚焦荧光显微镜下观察α-SMA的表达。

1.3.8 qPCR 检测lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 的mRNA表达 根据1.3.5分组对人胚肺成纤维细胞进行干预，收集细胞，Trizol-RNA 提取试剂盒提取细胞的总RNA，参照1.3.2 中的qPCR 检测方法检测lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 的mRNA 表达水平。lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4的引物序列见表1。

1.3.9 ELISA 测定Ⅰ型胶原及纤连蛋白的表达 将各组人胚肺成纤维细胞以1×104个/孔的密度接种于6 孔板中，细胞贴壁后，继续培养24 h，1 000 r/min 离心10 min，取各组细胞上清液。在Ⅰ型胶原及纤连蛋白抗体预包被的酶标板反应孔中依次加入标准品、对照品和样品（50 μL/孔），室温孵育2 h；
加100 μL 酶结合物工作液，室温避光孵育20 min；
加入50 μL 终止液终止反应。使用酶标仪在450 nm 测定光密度值，计算Ⅰ型胶原及纤连蛋白的蛋白表达水平。每组重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17．0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间的比较采用t检验；
多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较时若方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Tamhane法；
不同时间点的多组比较采用重复测量的方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2.1 RA-UIP 疾病相关lncRNA 的筛选和生物信息学分析 基因芯片检测发现，与RA对照组相比，RA肺纤维化组患者存在192 个上调表达的lncRNA（差异倍数＞1．1，P＜0．05），见图1。

Fig．1 Upregulated lncRNA in whole blood in the two groups图1 2组患者全血中表达上调的lncRNA

2.2 qPCR 验证差异lncRNA 与RA 对照组相比，RA 肺纤维化组lncRNA NONHSAT074080、NONHSAT071210、NONHSAT047350、NONHSAT101272、DPYD-IT1 及NONHSAT082317 的mRNA 表达明显升高（P＜0．05），而RP11-158I9．5．1-2：1、RP11-326I11．5、TMEM140-1：1及NONHSAT115197在2组间差异无统计学意义，见表2。

2.3 lnc-NONHSAT074080 的生物信息学分析 对上述结果中qPCR验证的6个在RA肺纤维化组高表达的lncRNA进行生物信息学分析，结果发现与纤维化生物学功能相关的为lnc-NONHSAT074080，见图2；
lnc-NONHSAT074080 可能作用的靶基因包括ARL6IP4，且为上调靶基因，见图3；
lnc-NONHSAT074080 可能通过分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、信号转导子和激活因子（STAT）等信号通路发挥作用，见图4。

Fig．2 Bioinformatics analysis showing biological function of lnc-NONHSAT074080图2 生物信息学分析lnc-NONHSAT074080的生物学功能

2.4 lnc-NONHSAT074080 对靶基因ARL6IP4 的调控作用 荧光素酶基因报告显示，空载体对照组、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 负对照组、pCDNA 3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2 组 和 pCDNA 3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2 组ARL6IP4 的荧光表达量分别为1．491±0．066、0．931±0．027、1．493±0．009 和1．149±0．039，差异有统计学意义（n=3，F=172．570，P＜0．05）。与空载体对照组相比，pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 负对照组ARL6IP4 的荧光表达量明显降低（P＜0．05）；
pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2组ARL6IP4 的荧光表达量较pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2负对照组升高（P＜0．05）。

Tab.2 Comparison of upregelated lncRNA expressions in whole blood between the two groups of patients表2 2组患者全血中上调表达的lncRNA表达水平比较（n=4，±s）

Tab.2 Comparison of upregelated lncRNA expressions in whole blood between the two groups of patients表2 2组患者全血中上调表达的lncRNA表达水平比较（n=4，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

组别RA对照组RA肺纤维化组t NONHSAT074080 1．000±0．002 6．108±2．180 2．343＊NONHSAT071210 1．000±0．317 2．447±0．212 6．097＊＊RP11-158I9．5．1-2:1 1．000±0．054 0．637±0．162 2．239 NONHSAT047350 1．000±0．253 3．868±0．728 3．911＊＊NONHSAT101272 1．000±0．002 2．885±0．517 3．646＊＊组别RA对照组RA肺纤维化组t RP11-326I11．5 1．000±0．003 3．396±1．487 1．611 DPYD-IT1 1．000±0．006 2．418±0．447 3．172＊TMEM140-1：1 1．000±0．065 3．453±1．300 1．886 NONHSAT115197 1．000±0．012 1．341±0．207 1．649 NONHSAT082317 1．000±0．004 2．099±0．237 4．643＊＊

2.5 lnc-NONHSAT074080 对人胚肺成纤维细胞增殖的影响 与空白对照组相比，TGF-β1组细胞增殖水平在干预24、48、72 和96 h 后升高（P＜0．05）；
与TGF-β1 组相比，TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组细胞增殖能力在干预48、72 及96 h 后明显下降（P＜0．05），见表3。

2.6 lnc-NONHSAT074080 对α-SMA 表达的影响 免疫荧光结果显示，与空白对照组相比，TGFβ1 组α-SMA 的荧光表达升高；
但TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA 组与TGF-β1 组相比，α-SMA的荧光表达明显减少，见图5。

2.7 lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 与纤维化的关系 与空白对照组相比，TGF-β1组的人胚肺成纤维细胞中lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 mRNA表达水平明显升高（P＜0．05）；
TGF- β1+NONHSAT074080 shRNA 组lnc-NONHSAT074080和ARL6IP4 mRNA 表达水平较TGF-β1 组明显降低（P＜0．05），见表4。

2.8 lnc-NONHSAT074080 对纤维化进程相关因子表达的影响 ELISA结果显示，TGF-β1组Ⅰ型胶原

Fig．3 bioinformatics analysis showing possible target gene of lnc-NONHSAT074080图3 生物信息学分析lnc-NONHSAT074080可能调控的靶基因

Fig．4 Boinformatics analysis showing signal pathways of lnc-NONHSAT074080图4 生物信息学分析lnc-NONHSAT074080作用相关的信号通路

Tab.3 The proliferation of different interventions in human embryonic lung fibroblasts at different time points表3 不同处理组人胚肺成纤维细胞各时间点的增殖水平（n=3，±s）

Tab.3 The proliferation of different interventions in human embryonic lung fibroblasts at different time points表3 不同处理组人胚肺成纤维细胞各时间点的增殖水平（n=3，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；
a与空白对照组比较，b与TGF-β1组比较，P＜0．05；
F时间=915．877＊，F组间=60．625＊，F交互=27．388＊。

组别空白对照组TGF-β1组TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组F 0 h 0．063±0．009 0．061±0．006 0．059±0．005 0．524 24 h 0．496±0．034 0．689±0．010a 0．804±0．018 51．234＊＊48 h 0．844±0．040 0．975±0．012a 0．739±0．113b 63．895＊＊72 h 1．088±0．019 1．336±0．016a 1．065±0．025b 39．174＊＊96 h 1．183±0．091 1．528±0．055a 1．098±0．025b 28．110＊＊

Fig．5 The expression of α-SMA in human embryonic lung fibroblasts treated with different interventions(×400,rhodamine dying）图5 不同处理组人胚肺成纤维细胞中α-SMA的表达（×400，四乙基罗丹明染色）

和纤连蛋白的表达高于空白对照组（P＜0．05）；
与TGF-β1 组比较，TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组Ⅰ型胶原和纤连蛋白明显降低（P＜0．05），见表5。

Tab.4 Comparison of lnc-NONHSAT074080 and ARL6IP4 gene expression between the three groups表4 各组lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表达水平（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of lnc-NONHSAT074080 and ARL6IP4 gene expression between the three groups表4 各组lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表达水平（n=3，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；
a与空白对照组比较，b与TGF-β1 组比较，P＜0．05。

组别空白对照组TGF-β1组TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组F lnc-NONHSAT074080 1．000±0．072 3．617±0．150a 1．676±0．177ab ARL6IP4 1．000±0．039 1．862±0．080a 1．072±0．131b 72．644＊＊32．106＊

Tab.5 Comparison of the expression levels of type I collagen and fibronectin between the three groups表5 各组I型胶原和纤连蛋白表达水平比较（n=3，μg/L，±s）

Tab.5 Comparison of the expression levels of type I collagen and fibronectin between the three groups表5 各组I型胶原和纤连蛋白表达水平比较（n=3，μg/L，±s）

＊＊P＜0．01；
a与空白对照组比较，b与TGF-β1组比较，P＜0．05。

组别空白对照组TGF-β1组TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA组F I型胶原2．490±0．098 7．008±0．344a 3．160±0．081ab 132．528＊＊纤连蛋白22．906±1．688 40．517±1．978a 23．058±1．505b 34．056＊＊

肺纤维化是RA-UIP 的主要特征，剖析纤维化发生发展相关的致病因素是深入研究RA-UIP 发病机制的关键。近年来，随着非编码RNA在肺纤维化发病中的研究不断深入，lncRNA在纤维化进程中的作用也开始受到关注［6］。研究发现，lncRNA ZFAS1在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织及TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞中高表达，且通过调控miR-150-5p/SLC38A1 轴发挥作用［7］。lncRNA AK088388和AK081523在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠体内高表达，并作用于miR-29b-3p 和let-7i-5p，调控N4bp2 和plxna4 基因的表达参与肺纤维化的发病［8］；
lncRNA CHRF 作用于miR-489 促进二氧化硅诱导的肺纤维化，miR-489 在肺纤维化小鼠巨噬细胞和TGF-β1 处理的成纤维细胞中的表达减低，通过调控靶基因MyD88 及Smad3 参与肺纤维化的发病［9］；
lncRNA uc．77 及lncRNA 2700086A05Rik调节肺泡上皮的间质转化，在肺纤维化的发生发展中发挥重要作用［10］。本研究收集RA-UIP 和RA 无ILD 的患者全血，以Affymetrix 基因芯片技术筛选差异表达的lncRNA，发现RA-UIP 患者全血中存在192 个上调表达的lncRNA，选择上调表达较明显的lncRNAs 进行PCR 验证，发现与RA 无ILD 的患者相比，lnc-NONHSAT074080 在RA 肺纤维化组患者全血中的表达明显升高，且生物信息学关于功能分析提示qPCR 验证的6 个高表达的lncRNAs 中，lnc-NONHSAT074080与纤维化进程相关。同时，体外实验采用TGF-β1 诱导肺成纤维细胞的纤维化进程，发现人胚肺成纤维细胞经TGF-β1 诱导后，lnc-NONHSAT074080表达较空白对照组明显升高，人胚肺成纤维细胞的增殖水平、肌成纤维细胞标志物α-SMA水平及纤维化进程相关的Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达水平也明显升高。为进一步证实lnc-NONHSAT074080在纤维化进程中的作用，笔者构建lnc-NONHSAT074080 shRNA 慢病毒载体转染人胚肺成纤维细胞，体外沉默lnc-NONHSAT074080 表达，发现与TGF-β1诱导后相比，人胚肺成纤维细胞的增殖水平明显下降，肌成纤维细胞标志物α-SMA表达降低，纤维化进程相关的Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达也明显下降，进一步证实了lnc-NONHSAT074080与纤维化进程的关系。

ARL6IP4 是Ras 家族的成员，可调控细胞凋亡［11］。目前关于ARL6IP4 功能的研究较少，尤其是ARL6IP4在纤维化进程中的作用尚不清楚。本研究通过生物信息学分析发现ARL6IP4 可能是lnc-NONHSAT074080 调控的靶基因之一。进一步验证发现lnc-NONHSAT074080 表达载体上调ARL6IP4基因的荧光素酶报告基因表达水平，沉默lnc-NONHSAT074080 后人胚肺成纤维细胞中ARL6IP4 mRNA表达水平下调，且TGF-β1诱导肺成纤维细胞中ARL6IP4 的mRNA 表达升高，提示lnc-NONHSAT074080 调控靶基因ARL6IP4 的表达，参与肺成纤维细胞的纤维化进程。

MAPK 信号通路和PPAR 信号通路是细胞内的主要信息传导系统，在肺纤维化发病中发挥重要作用［12-13］。在肺炎症/纤维化进程中，氧化磷酸化信号转导参与了肺成纤维细胞的纤维化进程，与间质性肺疾病发病相关［14］。MAPK 下游的转录因子被激活，如核因子κB（NF-κB）、激活蛋白-1（AP-1）及信号转导子和转录激活子（STAT）等，这些活化的转录因子调控一系列纤维化相关基因的表达，最终导致纤维化的产生［15-16］。笔者利用生物信息学对RAUIP 患者上调的差异lncRNA 基因进行功能和信号通路分析，发现这些表达上调lncRNA 可能与PPAR信号通路和氧化磷酸化有关，同时，对lnc-NONHSAT074080 的生物信息学分析也同样发现与MAPK信号通路和下游的STAT信号转导有关，具体的信号转导机制有待深入研究。

本研究发现RA-UIP 患者全血中lnc-NONHSTAT074080 高表达，且 lnc-NONHSTAT074080 调节肺成纤维细胞的增殖及纤维化相关因子的表达；
ARL6IP4 是 lnc-NONHSTAT074080 作用的靶基因，lnc-NONHSTAT074080 与纤维化相关信号通路MAPK、STAT 可能存在一定的关系。本研究对lnc-NONHSTAT074080在RA-UIP 发病中的作用进行初步分析，为更全面阐释其发病机制并寻找有效的治疗靶点提供实验依据。