实时荧光RNA恒温检测在气管支气管结核疗效监测中的应用价值

徐银娟 赵国连 崔晓利 党丽云 康磊 周永

近年来，随着内镜技术的日益进步与不断推广，气管支气管结核有增多趋势，并与10%～40%的活动性肺结核患者有合并感染[1]。但由于气管支气管结核抗结核治疗时间长、药物不良反应重[2]、缺乏灵敏且有效的疗效监测方法，难以实时掌握结核病患者病情和疗效变化，不利于及时调整治疗方案和降低传播风险，使得相当一部分患者的服药依从性较差，导致治疗失败或产生耐药。

随着支气管内镜治疗被广泛应用于气管支气管结核，支气管肺泡灌洗液标本的结核分枝杆菌检测也得以被广泛使用。这其中有多种分子诊断方法被用于结核分枝杆菌的直接检测，为结核病的诊断，特别是菌阴肺结核，提供了极大帮助。比如实时荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)、实时荧光RNA恒温检测技术(SAT-TB)，以及GeneXpert MTB/RIF，但这些方法在疗效监测方面的作用还有待探索。临床中，结核分枝杆菌DNA检测(如qRT-PCR)不能区分死菌和活菌，而结核分枝杆菌RNA检测(如SAT-TB)则可有效区分[3]，表现出较高的诊断价值[4-5]，但对两种方法应用于支气管肺泡灌洗液标本检测的对比研究并不多，故笔者通过分析SAT-TB和qRT-PCR对气管支气管结核支气管肺泡灌洗液标本中结核分枝杆菌的检出能力，为SAT-TB用于监测抗结核药物治疗气管支气管结核效果提供依据。

一、研究对象

采用回顾性研究方法，选取西安市胸科医院2021年1—12月确诊[2]且符合入组标准的168例初治气管支气管结核患者。所有患者均为病原学检测阳性，完成治疗，且有MGIT 960培养、SAT-TB和qRT-PCR检查结果；
均为排除合并糖尿病、肿瘤、其他免疫系统疾病者及相关检查不全者。168例患者中，男性66例(39.29%)，女性102例(60.71%)；
年龄中位数(四分位数)为32.5(26.2，53.8)岁。

二、 研究方法

所有患者均于入院1周内及开始抗结核药物治疗前(基线期)进行首次支气管镜检查并送检MGIT 960培养、SAT-TB和qRT-PCR检查，此后至少每4周进行1次支气管镜检查及送检以上3种方法检测。

1.标本收集及前处理：所有患者均经纤维支气管镜检查收集支气管肺泡灌洗液10～15 ml，再将标本混匀后分为3份，分别送检MGIT 960培养、SAT-TB和qRT-PCR检查。所有操作均按照《结核病实验室检验规程》[6]进行。因本研究有94例患者每2周做1次支气管镜，74例患者每4周做1次支气管镜，故本研究选择每2周做1次支气管镜的94例患者进行3种检测方法阳性率和检测效能评价的分析，选择全部患者进行阴转时间评价的分析。

2.MGIT 960培养及菌种鉴定：取2 ml混匀的支气管肺泡灌洗液标本按照1∶1体积加入4%NaOH溶液中处理15 min，3000×g离心20 min，弃上清后经0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤后取0.5 ml上清至配置好的MGIT培养管中，置于BACTEC MGIT 960培养仪中，由仪器自动监测并报告结果(仪器培养时间最长为42 d报告结果)。若BACTEC MGIT 960系统报告阳性，则取出培养管进行涂片抗酸染色以确认是否为抗酸杆菌，若抗酸杆菌阳性则进行MPB64蛋白免疫胶体金法(杭州创新生物检控技术有限公司)检测以进一步鉴定菌种，MPB64蛋白阳性为结核分枝杆菌，阴性则为非结核分枝杆菌。若 BACTEC MGIT 960系统报告阴性，则视为分枝杆菌培养阴性。

3.SAT-TB：取1 ml支气管肺泡灌洗液标本液化离心洗涤后，加50 μl RNA裂解缓冲液，超声15 min(功率300 W)，15 000×g离心5 min，上清即为扩增模板。采用结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(RNA 恒温扩增；
购自上海仁度生物科技股份公司)，按照试剂盒说明书进行操作。扩增仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。仪器每分钟捕获1次荧光，实验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度判断。仪器捕获荧光产生的样本曲线与阈值线(阈值线设置为超过正常阴性对照扩增曲线的最高点)交点横坐标读数即为dt值(探测时间，detection time，1dt=1 min)。dt值<40为阳性，dt值≥40为阴性。

4.qRT-PCR：取1 ml支气管肺泡灌洗液标本液化离心洗涤后，向沉淀中加入50 μl核酸提取液并转入带磁珠的核酸提取管中，提取仪快速振荡10 min，然后95 ℃水浴5 min，取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR扩增试剂中进行扩增。扩增试剂为分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法；
北京博奥晶典生物科技有限公司)，扩增仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。按照说明书操作。

三、统计学处理

使用SPSS 18.0软件进行数据的统计分析。计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”描述，两组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验；
计数资料以“百分率(%)”描述，两组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。一致性检验Kappa值介于0.00～0.20为极低一致性，0.21～0.40为一般一致性，0.41～0.60为中等一致性，0.61～0.80为高度一致性，0.81～1.00为几乎完全一致。当一致性检验受结果分布影响较大时，采用符合率和受试者工作特征(ROC)曲线分析，计算曲线下面积(AUC)，AUC越接近于1，说明诊断效果越好；
AUC介于0.7～0.9表明诊断具有一定准确性，介于0.5～0.7为准确性较低，<0.5为无诊断价值。

一、三种方法在气管支气管结核患者治疗期间检测阳性率下降情况

对每2周做1次支气管灌洗的94例患者标本进行MGIT 960培养、qRT-PCR和SAT-TB检测结果的分析，发现三者从基线至治疗12周的阳性率均呈下降趋势，其中，qRT-PCR和SAT-TB从基线至12周阳性例数下降幅度分别为67.81%(59/87)和82.95%(73/88)，均低于MGIT 960培养的98.78%(81/82)，差异均有统计学意义(χ2值分别为28.472和12.469，P值均<0.001)，即qRT-PCR和SAT-TB阳性率下降慢于MGIT 960培养法。另外，qRT-PCR和SAT-TB在基线期与MGIT 960培养阳性率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)，但治疗2、4、6、8、10及12周时的阳性率均明显高于MGIT 960培养，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。具体见表1和图1。

表1 以MGIT 960培养为参照标准qRT-PCR和SAT-TB检测94例气管支气管结核患者标本的阳性情况

图1 治疗期间三种方法检测阳性率下降情况

二、qRT-PCR和SAT-TB以MGIT 960培养结果为参照标准的检测效能

以MGIT 960培养结果为参照标准，qRT-PCR对上述94例患者在不同检测点(基线，治疗2、4、6、8、10及12周)检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值、符合率和ROC曲线下面积(AUC)均明显低于SAT-TB，具体见表2。

表2 qRT-PCR和SAT-TB以MGIT 960培养结果为参照标准对94例气管支气管结核患者的检测效能

续表2

三、MGIT 960培养不同阴转时间与SAT-TB检测肺泡灌洗液标本dt值的关系

根据MGIT 960培养阴转时间将168例气管支气管结核患者分为3组，即1～4周组(74例)、5～8周组(68例)和9周及以上组(26例)。分析不同MGIT 960阴转时间组首次肺泡灌洗液标本SAT-TB检测dt值的差异。结果显示，1～4周组的dt值[7.264(4.891，10.990)]与5～8周组[5.113(3.520，6.390)]和9周及以上组[5.222(4.068，6.886)]的差异均有统计学意义(Z=-4.318，P<0.001；
Z=-2.017，P=0.044)，但5～8周组与9周及以上组的dt值差异无统计学意义(Z=-1.219，P=0.223)。

SAT-TB是建立在实时荧光检测技术和RNA恒温技术基础上的新一代核酸检测技术，其原理是以结核分枝杆菌特异的16S rRNA为检测靶标，在M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶的共同作用下实现核酸恒温扩增RNA，荧光标记的探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号，并用仪器进行实时荧光检测，从而判断样本中是否存在结核分枝杆菌。SAT-TB技术30 min左右可将模板扩增109倍[7]，大大减少了检测时间，具有反应速度快和扩增效率高的特点。又因RNA在结核分枝杆菌死亡后会很快降解，故其仅存在于活菌中，因此，以RNA作为检测靶标不仅可以区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，还可以监测抗结核治疗效果[8]。

有研究发现，女性是肺结核患者合并支气管结核的危险因素[9]。本组气管支气管结核患者多为中青年，且女性多于男性，约为2∶1，与以往报道基本接近[10-11]，进一步提示应关注女性肺结核患者合并支气管结核状况。对94例2周进行1次支气管镜灌洗检查的患者治疗期间的MGIT 960培养、qRT-PCR 和SAT-TB检测结果进行分析，发现qRT-PCR和SAT-TB在基线期的检测阳性率(92.55%和93.62%)与MGIT 960培养(87.23%)的差异均无统计学意义，说明3种方法对于患者初诊时的检测能力相近。但3种方法在治疗监测期间，从治疗第2周至第12周的阳性检出率均呈下降趋势，且qRT-PCR和SAT-TB的下降幅度均明显低于MGIT 960培养，即MGIT 960培养的阳性率下降最快，qRT-PCR下降最慢。笔者分析原因可能为：首先，MGIT 960培养检测的敏感度通常低于分子生物学方法[12]，且随着治疗过程中排菌量的减少及细菌活性降低，部分患者会出现培养阴性早于分子生物学检测的情况，这可能是在治疗过程中有很多患者已没有活菌排出，但其排出的死菌或者残留的结核分枝杆菌DNA片段却可以造成qRT-PCR检测“阳性”。其次，SAT-TB是以RNA作为检测的靶标，假阳性的检测概率较低，较qRT-PCR能更迅速地反映当前治疗效果，可作为疗效监测的重要检测方法。但本研究显示SAT-TB检测阳性率较MGIT 960培养仍有一定滞后性，这一结果与胡永领等[13]研究结果有所差异，该研究在长达6个月的动态观察中发现SAT-TB与MGIT 960培养阳性率始终不相上下，这可能是由于试剂、实验室操作及研究人群差异导致。

以MGIT 960培养结果为参照标准对qRT-PCR与SAT-TB进行检测效能分析，发现在治疗开始至12周各检测点SAT-TB的检测效能指标均高于qRT-PCR，与MGIT 960培养的一致性均高于qRT-PCR，但在不同检测点的检测一致性程度差异较大，Kappa值介于0.107～0.620之间，考虑到一致性检验受结果分布影响较大，故笔者又采用符合率和ROC曲线分析qRT-PCR和SAT-TB与MGIT 960培养的一致性程度。结果发现，从基线至治疗第12周检测，SAT-TB与MGIT 960培养的符合率(63.83%～89.36%)和AUC(0.642～0.814)也均明显高于qRT-PCR(48.94%～84.04%；
0.553～0.715)，这与吴联朋[14]的研究结果基本一致。说明SAT-TB与MGIT 960培养的一致程度更高，总体检测效能更好，同时也意味着疗效监测效果更好。

SAT-TB检测产生的实时放大信号dt值可用于结核分枝杆菌的相对定量，有助于结核病治疗的临床管理。笔者探讨了在不同MGIT 960培养阴转时间首次SAT-TB检测dt值的差异，结果显示，1～4周内阴转患者的dt值明显高于4周以上阴转患者的dt值，差异有统计学意义；
而5～8周阴转患者的dt值与9周及以上阴转患者的dt值差异无统计学意义，这可能是抗结核治疗后第1个月的菌载量下降得最快，而1个月后的下降趋于缓慢，且下降幅度基本平稳的原因。这一结果也被胡永领等[13]研究所证实，提示如果抗结核治疗4周内细菌载量下降明显，则可预示患者阴转时间快，治疗效果良好。

综上所述，SAT-TB用于病原学阳性气管支气管结核患者的疗效监测时，监测效果与MGIT 960培养的一致性高。但是相对于MGIT 960培养周期长的严重不足，SAT-TB更能满足临床快速诊断的要求。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献徐银娟和赵国连：设计实验、实施具体研究、收集分析数据、撰写文章及审阅修改；
崔晓利和党丽云：参与设计、完善实验步骤、帮助实施研究、分析解释部分数据；
康磊和周永：指导部分研究、帮助采集分析数据