基于磁性金属有机框架模拟酶电化学检测邻苯二酚的研究

关桦楠， 邢 珂， 张 悦， 刘树萍

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076；
2.哈尔滨商业大学旅游烹饪学院，黑龙江哈尔滨 150076)

邻苯二酚(CC)，又称儿茶酚，是化学生产、农药、橡胶染料中常见有机污染物。邻苯二酚被国际癌症研究机构列为潜在致癌物，即使浓度为5～25 ppm，也被认为对生物具有毒性[1 - 3]，因此，开发简单、快速、灵敏的邻苯二酚检测方法就显得尤为重要。与常用的检测方法如高效液相色谱法(HPLC)[4]、荧光探针法[5]和化学发光分析法[6]等相比，电化学生物传感分析技术具有操作简单、灵敏度高、选择性好等优点[7,8]，并且有很好的应用和开发前景。

大多数电化学生物传感分析技术的核心原件是以天然酶为基础进行分析检测的，而天然酶却因其高昂的制备成本、不稳定性和难再生等不足，严重限制了其实际应用[9,10]。为解决电化学生物传感分析技术中天然酶的不足，纳米模拟酶逐渐成为研究热点。与天然酶相比，基于纳米材料的人工模拟酶因其成本低、稳定性高而受到越来越多的关注，其中金属-有机框架材料(metal-organic frameworks，MOFs)以其可调的结构、高孔隙率、高催化活性和高稳定性等特点引起了广泛的研究兴趣[11,12]。然而，单MOFs的酶活性较差，因此通常在单MOFs的基础上添加其他纳米材料来制备复合MOFs，以提高酶的活性[13]。在众多纳米材料中，Fe3O4和金纳米粒子(AuNPs)均具有过氧化物模拟酶活性，添加到MOFs中可以显著提高复合纳米粒子的过氧化物模拟酶活性和催化能力[14,15]。Fe3O4@Au/MOF模拟酶具有AuNPs良好的稳定性和重复性[16]，并且可以提高体系的灵敏度和选择性[17]，也具有Fe3O4可以被磁铁回收和再利用[18]的优点。

本文通过将Fe3O4磁性粒子和Cu2+分散在对苯二甲酸(PTA)形成的二维网络结构中，合成了铜基金属有机框架(Fe3O4@Cu-MOF)，同时将金纳米粒子嵌入网络结构后，制备出具有过氧化物酶活性的新型金属有机框架模拟酶(Fe3O4@Au/MOF)。Fe3O4@Au/MOF可催化分解体系中的H2O2，释放出具有氧化活性的羟基自由基，进一步加速电化学信号物质邻苯二酚在玻璃碳电极表面的氧化反应，从而增加系统中电荷的运动产生微电流，进而提高电化学检测体系的的灵敏度。利用Fe3O4@Au/MOF模拟酶构建增强的电化学检测邻苯二酚系统，成功用于检测饮用水中的邻苯二酚。鉴于此，基于模拟酶的电化学检测技术将为环境分析、食品分析以及生物医学检测等领域提供一种新思路。

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海晨华仪器有限公司)：采用三电极结构体系，包括玻璃碳电极(GCE)作为工作电极，铂电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极；
YH-101水热反应釜(河南裕华仪器科技有限公司)；
F200X S透射电子显微镜(北京欧博通光学技术有限公司)；
EDK 9500傅里叶变换红外光谱仪，X射线光电子能谱仪(北京杜克科技有限公司)。

邻苯二酚购自广福精细化工研究所；
FeCl3·6H2O，NaAc·3H2O，HAuCl4，CuSO4，NaBH4，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG-4000)，乙二醇，对苯二甲酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，2,2′-氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)等试剂均购于科密欧化学试剂有限公司。

1.2 Fe3O4@Au/MOF的合成

采用水热法制备Fe3O4纳米颗粒。分别将3 g的FeCl3·6H2O、6.3 g的NaAc·3H2O和1.8 g的PEG-4000依次加入到装有80 mL乙二醇的烧杯中。充分震荡30 min后，将混合均匀的溶液转移至水热反应釜中，在200 ℃条件下恒温反应8 h。反应结束后，冷却至室温，离心去上清液，分别采用乙醇和去离子水依次清洗黑色沉淀3个循环，随后将沉淀真空干燥至恒重，此为所制备的Fe3O4纳米颗粒，常温保存备用。

采用改良的绿色还原法[19]，以新鲜的橘子皮为原料，制备金纳米粒子。将20 g切碎的橘子皮在80 ℃的去离子水中浸泡1 h，然后将滤液以3 500 r/min离心5 min，得到上清液。用去离子水稀释上清液，得到橙皮备用溶液，并在4 ℃下保存。将20 mL预冷4 ℃的HAuCl4加入至烧杯中，放置于磁力搅拌器上均匀搅拌，并迅速向烧杯中加入5 mL橘子皮备用液。随着搅拌速度的不断加快，体系的颜色从黄色变为酒红色并在30 min内没有变化时，即反应结束。金纳米粒子定量为31.3 mg/mL，合成的含有金纳米粒子的溶液需要保存在4 ℃的环境下。

将2 g合成的Fe3O4纳米粒子和10 mL 99.7%的乙醇在摇床上充分混合30 min。然后再依次加入3 g PVP、20 mL的乙醇和45 mL的DMF，并超声震荡处理45 min。加入10 mL Cu2+标准溶液和2 g对苯二甲酸粉末，摇床震荡反应30 min。将混合后的溶液置于200 ℃的水热反应釜中反应6 h。用乙醇和蒸馏水对混合溶液进行3次洗涤。将清洗后的金属有机框架(Fe3O4@Cu-MOF)置于真空干燥箱中，干燥至恒重，备用。

将Fe3O4@Cu-MOF进行超声波震荡处理，使之分散在5 mL蒸馏水中，加入5 mL所制备金纳米粒子凝胶工作液，在摇床中缓慢晃动6 h，然后加入10 mL浓度为0.1 mol/L的NaBH4水溶液，超声处理45 min。最后，用蒸馏水清洗，再干燥至恒重后得到Fe3O4@Au/MOF二维磁性金属有机框架。

2.1 Fe3O4@Au/MOF的表征

采用透射电子显微镜对所制备的Fe3O4@Au/MOF粒子的表观形貌进行表征。由图1可知，Fe3O4@Au/MOF是由表面粗糙的分散球体组成的磁性团簇。Fe3O4磁性纳米粒子具有磁性吸引力和范德华力，所以Fe3O4纳米粒子易产生聚集，导致分散稳定性差。将AuNPs固定在其表面可以有效降低Fe3O4纳米粒子之间的聚集效应，提高复合纳米粒子的催化活性。根据TEM图像显示，磁性纳米粒子和AuNPs均匀地分散在Fe3O4@Au/MOF团簇中，并成功地与铜基金属有机框架结合。

图1 Fe3O4@Au/MOF金属有机框架在50 nm(a)和200 nm(b)下的透射电子显微镜(TEM)Fig.1 TEM images of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework at 50 nm (a) and 200 nm (b)

用X射线光电子能谱(XPS)来进一步分析Fe3O4@Au/MOF复合材料的组成。在XPS光谱中，三个突出的峰分别是Fe 2p,Au 4f和Cu 2p。如图2a所示，Fe 2p的高分辨率XPS光谱包含两个结合能，分别为710.55和724.32 eV。这两个结合能代表了Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的双峰，即Fe3O4磁性粒子的特征峰。根据图2b和2c可以看出，在93.55 eV和932.52 eV处可以观察到Au 4f和Cu 2p的光谱，这意味着AuNPs和Cu2+已经成功嵌入Fe3O4@Au/MOF复合纳米粒子中。

图2 Fe3O4@Au/MOF金属有机框架中Fe (2p) (a),Au (4f) (b)和Cu (2p) (c)的X射线光电子能谱Fig.2 X-ray photoelectron spectra of Fe (2p) (a),Au (4f) (b) and Cu (2p) (c) in Fe3O4@Au/MOF

图3 Fe3O4@Au/MOF金属有机框架的红外光谱Fig.3 FT-IR spectrum of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework

对Fe3O4@Au/MOF进行了FT-IR检测，如图3所示。在560.19 cm-1处的峰值来自磁性颗粒中Fe-O键的振动；
由于C-O拉伸，约在1 117.31 cm-1处产生了吸收峰；
1 631.33 cm-1处产生的吸收峰是由于氨基的存在。在2 250～2 750 cm-1之间有两个吸收峰分别来自长链烷基-CH2和-CH3的振动，此外，3 846.44 cm-1处为-OH键的特征峰。

2.2 Fe3O4@Au/MOF复合材料的模拟酶活性的验证

设计5个不同的反应体系：(1)H2O2+Fe3O4@Au/MOF；
(2)单独邻苯二酚；
(3)邻苯二酚+Fe3O4@Au/MOF；
(4)H2O2+邻苯二酚；
(5)H2O2+Fe3O4@Au/MOF+邻苯二酚。采用循环伏安法(CV)监测5个体系氧化峰电流的变化情况。以在H2O2存在下，邻苯二酚的催化氧化反应程度来评估Fe3O4@Au/MOF的过氧化物酶活性。

图4 Fe3O4@Au/MOF过氧化物模拟酶活性的电化学验证Fig.4 Electrochemical validation of Fe3O4@Au/MOF peroxidase-like activity

如图4所示，在Fe3O4@Au/MOF的存在下，低浓度的H2O2不能产生氧化电流峰，说明玻璃碳电极表面没有可产生电流的移动电子，或者体系中的反应不满足产生电流的反应条件。当HAc-NaAc缓冲体系中只有邻苯二酚时，产生了微弱的电化学信号，这是因为邻苯二酚具有独特电化学活性[20]。邻苯二酚+Fe3O4@Au/MOF缓冲溶液体系和H2O2+邻苯二酚缓冲溶液体系都产生了较为突出的氧化峰电流，并且电流呈上升趋势。因为Fe3O4@Au/MOF催化了溶液中的几种氧化性物质并与邻苯二酚发生反应，从而促进了电子转移。与其他体系相比，H2O2+Fe3O4@Au/MOF+邻苯二酚体系的氧化电流峰值明显增大。这是因为Fe3O4@Au/MOF作为过氧化物模拟酶，催化H2O2重新引入大量的氧化活性物质(主要是具有氧化活性的·OH和HOO·自由基)，进一步促进了邻苯二酚的氧化。结果表明，Fe3O4@Au/MOF表现出了过氧化物酶模拟酶的活性，有效催化H2O2并进一步氧化邻苯二酚，因此它可以加入到邻苯二酚的电化学检测中，以提高检测灵敏度。

2.3 单因素优化Fe3O4@Au/MOF模拟酶电化学检测体系

将不同添加量的Fe3O4@Au/MOF(0.050、0.075、0.10、0.125和0.150 g)分别加入不同pH值(4、5、6、7和8)的10 mL HAc-NaAc缓冲溶液中混匀，并将其加热至不同的恒定温度(40、50、60、70和80 ℃)，加入600 μL 50 mmol/L H2O2标准溶液，充分反应10 min后，再加入200 μL 0.01 mmol/L的邻苯二酚标准溶液，并采用不同扫描速率(0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 V/s)的电化学工作站进行检测。再进行正交试验设计优化实验，筛选出最佳检测条件。

图5 不同因素对电化学检测体系的影响Fig.5 Effect of different factors on the electrochemical detection system(a)the reaction temperature;(b) Fe3O4@Au/MOF addition amount;(c) the scan rate;(d) pH of buffer solution

从图5a可以看出，当温度在40～70 ℃范围内时，反应速率随着温度的上升而提高。由于温度变化导致邻苯二酚的溶解度增加，与Fe3O4@Au/MOF催化产生的自由基充分反应，所以|Ipa|持续上升。当温度超过70 ℃时，|Ipa|下降，这是由于Fe3O4@Au/MOF模拟酶的活性在较高温度下受到抑制。因此，在正交优化设计实验时选择温度为60、70、80 ℃。如图5b所示，当Fe3O4@Au/MOF的添加量在0.005至0.075 g时，|Ipa|上升速率最快。体系中的模拟酶活性增强会促进H2O2产生更多的氧化活性自由基，使电子加快转移速度、增加转移数量。然而，当继续添加Fe3O4@Au/MOF时，体系的|Ipa|依然上升但上升速度逐渐变慢，是因为当体系中存在大量的Fe3O4@Au/MOF时，纳米粒子会进一步聚集，导致复合酶的催化活性逐渐降低。因此选择模拟酶添加量0.10、0.125和0.150 g参与正交试验设计优化实验。图5c中邻苯二酚的|Ipa|随着扫描速率的增加而不断增加，这进一步证明了邻苯二酚在GCE上的电化学过程是扩散控制过程[21]。从0.08 V/s到0.1 V/s的上升速率已经明显降低，故没有必要研究超过0.1 V/s的扫描速率。因此选择了0.06、0.08和0.1 V/s三个级别，参加正交设计的优化实验。由图5d可以看出，氧化电流峰值在pH=5时达到最高点，随着pH值的不断增加，当pH值在5～8范围内变化时，|Ipa|明显呈下降趋势。这是因为质子参与了体系中的氧化还原反应[22]，随着pH值的增加，体系中的质子持续减少，所以系统中的电子转移量和电化学反应都减少了。根据结果可知，酸性和碱性环境都会抑制反应的进行。因此，选择pH值4.0、5.0和6.0继续进行正交设计的优化实验。

2.4 正交试验设计优化Fe3O4@Au/MOF模拟酶电化学检测体系

在单因素试验的基础上，选择温度(A因素)、Fe3O4@Au/MOF添加量(B因素)、扫描速率(C因素)和pH值(D因素)4种因素进行正交优化试验设计，研究对整个实验的影响。测定指标为氧化峰电流绝对值μA，用L9(34)正交表优化实验。如表1所示，正交试验分析的结果表明，最佳组合为A1B3C3D2，即反应温度为60 ℃，Fe3O4@Au/MOF添加量为0.15 g，扫描速率为0.1 V/s，pH值为5.0；
根据结果可知，扫描速率是影响体系的主要因素，H2O2浓度、添加量和pH对邻苯二酚含量的测定也有相应的影响。在最佳条件下进行了平行试验，结果表明，该Fe3O4@Au/MOF模拟酶电化学检测体系具有良好的精密度。

表1 正交实验结果分析

图6 不同浓度邻苯二酚的CV曲线(a)及检测邻苯二酚的工作曲线(b)Fig.6 CV curves of the different concentrations of catechol (a) and the calibration curve for the detection of catechol(b)

2.5 电化学检测邻苯二酚工作曲线及回收率

在最佳检测条件检测了不同浓度邻苯二酚在系统中的氧化还原反应行为。如图6a所示，随着邻苯二酚的浓度从0.001到0.1 mmol/L的增加，|Ipa|也呈现增加趋势。此外，从图6b可以看出，邻苯二酚在0.001 到0.1 mmol/L的浓度范围内与|Ipa|有良好的线性关系，工作曲线的回归方程为|Ipa|=2 048.5c+67.83，R2=0.9912。同时检测限为1.12×10-7mol/L(S/N=3)，回收率在98.8%～105.1%之间。结果表明，Fe3O4@Au/MOF模拟酶催化的电化学检测体系对检测邻苯二酚具有较高的灵敏度和精密度。

2.7 电化学检测邻苯二酚的抗干扰性研究

在最佳检测条件下，研究模拟食品废水中浓度为10 mmol/L的6种常见物质蔗糖、葡萄糖、CaCl2、NaCl、KCl和MgSO4，作为干扰物质来评估体系的抗干扰性能。干扰物质的浓度是邻苯二酚的100倍。如图7所示，与较高浓度的干扰物质相比，检测体系对邻苯二酚显示出明显的电流响应。这表明，基于Fe3O4@Au/MOF模拟酶的电化学检测体系在检测邻苯二酚时表现出良好的选择性和抗干扰性能。

图7 邻苯二酚检测体系的抗干扰性Fig.7 Interference resistance of the catechol detection system

2.8 实际样品检测

将优化后的电化学检测体系应用于实际样品中邻苯二酚的检测，选择在饮用水中加入不同浓度的邻苯二酚标准溶液来进行检测，并进行加标回收实验。结果如表2所示，标准品的回收率为95.5%～106.3%，RSD小于2.05%，说明该电化学检测体系对实际样品具有良好的添加回收率和精确度，可以实现对实际样品中邻苯二酚的检测。

表2 实际样品的加标回收率

本文成功构建了基于Fe3O4@Au/MOF的电化学生物传感器，该传感器将电化学检测技术与金属有机框架模拟酶相结合，实现了对邻苯二酚的高效、定量分析检测。在H2O2的存在下通过自组装方法合成的Fe3O4@Au/MOF，可以催化邻苯二酚的氧化还原反应。该电化学传感器表现出优异的灵敏度和对共存分子更强的抗干扰能力，并且对邻苯二酚具有良好的电化学响应线性关系及回收率，可应用于实际样品饮用水的检测。因此，Fe3O4@Au/MOF电化学生物传感器具有优异的检测环境污染物的潜力。