黄芪多糖与丹酚酸,B,配伍对,TGF-β1,诱导的肺上皮细胞间质转化的影响

李晗 宋玲 高云航 陈腾飞 侯红平 叶祖光 张广平

肺纤维化是由多种因素所致严重的肺间质慢性疾病,为众多肺部疾病的最终表现结果。

该病早期以下呼吸道急性炎症反应为主,后期发展为成纤维细胞过度增殖与细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)过量沉积,最终导致呼吸衰竭。

肺纤维化成因复杂,具体发病机制尚未完全阐明,因此该疾病也成为呼吸系统最严重疾病之一[1]。

当前研究发现肺泡上皮—间质转化( epithelialmesenchymal transition,EMT)是纤维化形成中的关键,因此有学者认为抑制EMT 是预防纤维化的有效手段[2-3]。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是 EMT 过程的总开关,其可促进间质细胞的增殖和分化,促进ECM 的沉积,因此其被认为是最重要的致纤维化因子[4]。

迄今,临床治疗肺纤维化多选用吡非尼酮、尼达尼布和糖皮质激,该药物虽能改善肺部炎症的发生与延缓纤维化进展,但均伴有严重的胃肠道副作用[5]。

如何利用传统中医理论和中药来治疗肺纤维化,已经成为科研人员关注的热点。

在中医古籍中并无“肺纤维化”的记载,但根据其临床症状,多将其归属于“肺痿”与“肺痹”的范畴,且病机主要为“气虚血瘀”,基本治疗方法则多采用益气活血法,选用黄芪丹参相伍,益气活血,补而不滞。

同时,本课题组前期发现,黄芪多糖(astragalus polysaccharides, APS) 与 丹 酚 酸 B(salvianolic acid B,Sal B)配伍具有改善博来霉素致大鼠肺纤维化的作用,且丹酚酸对TGF-β1 诱导的EMT 具有抑制作用[6]。

因此本研究在前期已确定黄芪多糖与丹酚酸B 具有抗PF 药效作用基础上,以人肺泡上皮细胞株A549 为研究对象,进一步揭示黄芪多糖与丹酚酸B 配伍对TGF-β1 诱导的肺上皮细胞间质转化的影响。

1.1 细胞株

人肺泡上皮细胞A549 细胞株,购于北京协和医院研究所细胞库。

1.2 药物与试剂

黄芪多糖(上海赫澎科技生物公司,批号:HPBIO-B549);丹酚酸B(成都曼思特科技生物公司,批号:MUST-18070503);TGF-β1 人重组蛋白(美国Peprotech 公司,批号:081735);二甲基亚砜(美国Sigma 公司);1640 培养基(美国 Gibco 公司,批号:8119258);FBS 胎牛血清(美国 Gibco 公司,批号:2019-05-07);胰蛋白酶(上海Sangon Biotech 公司,批号:T1350);MTS 细胞存活率试剂盒(美国Promega 公司,批号:0000352619);人源纤连蛋白和人I 型胶原蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉华美生物科技有限公司,批号:J05037340、J23037588);RNA 提取试剂盒(北京天根生物有限公司,批号:U9019);反转录与real time PCR 试剂盒(北京全式金公司,批号:51219);Western blot 凝胶电泳配制试剂盒与BCA 蛋白定量试剂盒(北京康为世纪公司,批号:40415);一抗E-Cadherin 抗体(美国 Cell Signaling Technology 公司,批号:14472S),一抗α-SMA 抗体和Vimentin 抗体(英国Abcam 公司,批号: GR282976-35、 GR3186827-26); 二 抗 HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG 抗体(上海碧云天生物技术有限公司,批号:A2016);其他化学与生物试剂均为国产分析纯。

1.3 主要实验仪器

二氧化碳培养箱(美国 Thermo 公司);Eppendorf5810R 型台式高速离心机(德国Eppendorf公司);CKX53 型倒置显微镜(日本Olympus 公司);SpectraMax i3x 型多标记酶标仪(美国 Molecular Devices 公司);Western blot 垂直电泳槽(美国 Bio-Rad);Western blot 转膜仪(美国 Bio-Rad 公司);SCILOGEX 180-E 水平摇床(杭州奥盛仪器有限公司);凝胶成像仪(美国GE 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 取冻存于-80℃低温冰箱的人肺泡上皮A549 细胞,快速转移至37℃水浴锅中进行解冻,生长在含有10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素—链霉素、1%非必需氨基酸的1640 培养基中,于37℃,5% CO2饱和湿度的条件下贴壁培养,待细胞汇合至80%时,按1 ∶3 的比例传代,取对数生长期的细胞用于实验。

1.4.2 细胞活力测定(MTS)法筛选出黄芪多糖与丹酚酸B 单用的安全浓度 待A549 细胞培养至对数期时,将该细胞以2×104个/孔细胞的密度接种于透明96 孔板,常规培养24 小时后,显微镜下观察,待细胞融合至80%时,换成无血清培养基,饥饿处理12 小时。

实验分为空白组、黄芪多糖组(10、20、40、60、80 mg/L)、丹酚酸 B 组(10、20、40、60、80 mg/L),每组设3 个复孔。

确定安全浓度后培养24、48 小时后,向 96 孔板中加入 20 μL/孔的 MTS,放置37℃,5% CO2 培养箱中避光孵育2 小时,孵育完毕后,利用酶标仪测定波长为490 nm 处的吸光度OD 值。

1.4.3 MTS 法筛选出黄芪多糖与丹酚酸B 配伍的安全浓度 待A549 细胞培养至对数期时,将该细胞以2×104个/孔细胞的密度接种于透明96 孔板,常规培养24 小时后,显微镜下观察,待细胞融合至80%时,换成无血清培养基,饥饿处理12 小时。

实验分为空白组、黄芪多糖组(60 mg/L APS)、丹酚酸B 组(60 mg/L Sal B)、配伍组(60 mg/L APS + 60 mg/L Sal B),每组设 3 个复孔。

培养 24、48 小时后,向96 孔板中加入20 μL/孔的 MTS,放置37℃,5% CO2培养箱中避光孵育2 小时,孵育完毕后,利用酶标仪测定波长为490 nm 处的吸光度OD 值。

1.5 检测指标

1.5.1 MTS 法检测芪多糖与丹酚酸B 配伍对TGF-β1诱导的肺上皮细胞增殖的影响 取对数生长期的A549 细胞,以 2×104个/孔细胞密度接种于 96 孔板,培养24 小时后于光镜下观察,细胞状态稳定、贴壁生长及增殖状态正常。

在前期实验筛选出对A549 细胞无增殖抑制的浓度范围下,将细胞分为空白组、模型组(5 μg/mL TGF-β1)[7]、丹酚酸 B 组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B)、黄芪多糖组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L APS)、配伍组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B+60 mg/L APS)每组设3个复孔。

培养 24、48 小时后,向 96 孔板中加入20 μL/孔的MTS,放置37℃,5% CO2培养箱中避光孵育2 小时,酶标仪测定波长为490 nm 处的吸光度OD 值。

1.5.2 实时荧光定量PCR 法(real-time PCR,RTPCR)检测 E-钙黏蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(vimentin,Vim)的转录水平 将对数生长期的A549 细胞以细胞数3×105/孔接种于6 孔板中,将细胞分为空白组、模型组(5 μg/mL TGF-β1)、丹酚酸 B 组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B)、黄芪多糖组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L APS)、配伍组(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B+60 mg/L APS),药物处理24 小时后,消化离心得到细胞,每个EP管中加入Trizol 提取细胞总RNA,用紫外分光光度计检测RNA 浓度和纯度(OD260/OD280 的值为1.8 ~2.0)。

取总 RNA 1 000 ng,按照说明书将总RNA 逆转录成cDNA 后进行RT-PCR 检测,检测采用Syber Green 法,PCR 反应条件为预变性94℃ 20秒,循环时94℃ 5 秒,60℃ 15 秒,72℃ 10 秒,共40个循环,最终所得数据以 2-(ΔCt实验对照组-ΔCt空白对照组)值表示各目标基因mRNA 相对表达水平,引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.3 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E-Cad、α-SMA 和Vim 的蛋白表达 将对数生长期的A549细胞以3×105个/孔的密度接种于6 孔板中,待细胞融合至80%时,分组及加药同“1.5.2”项。

培养24小时后,胰酶消化离心法收集细胞,每个EP 管中加入含蛋白酶抑制剂的裂解液100 μL 提取全蛋白。加入裂解液后,将EP 管置于冰浴中裂解30 分钟,反复吹打,12 000 r/分钟、4℃条件下离心10 分钟,即得到蛋白。

BCA 法测定蛋白浓度,将蛋白加入loading buffer 后,于 100℃、10 分钟条件下变性,50 μg蛋白经8%SDS-PAGE 电泳后分离,切胶后,将蛋白电转移至PVDF 膜,室温下用5%脱脂牛奶封闭1 小时,并孵育 E-Cad(1 ∶1 000)、Vim(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶1 000)与 GAPDH(1 ∶1 000)的一抗,4℃封闭过夜,TBST 洗膜3 次,孵育二抗(1 ∶1 000),置于摇床上室温孵育1 小时,TBST 洗膜3 次,加入ECL避光显色,显影后利用凝胶成像系统拍照记录,并用Image J 软件计算灰度值,以目的蛋白与GAPDH 蛋白灰度值的比值作为各组蛋白表达的相对含量。

1.5.4 酶联免疫吸附法检测纤连蛋白(fibronectin,FN)和I 型胶原蛋白(collagen-I,Col-I)的含量 将对数生长期的A549 细胞以3×105个/孔接种于6 孔板,待细胞融合至80%时,分组及加药同“1.5.2”项。

加药后细胞放置于37℃,5% CO2培养箱中培养24 小时后,收集细胞培养液,并于4℃,3 000 r/分钟离心15 分钟以去除培养液中的细胞碎片及杂质,取上清。

采用BCA 法测定蛋白总浓度,按照试剂盒说明书,按照FN 和Col-I 酶联免疫检测试剂盒说明书进行检测。

1.6 统计学处理

实验所得数据为计量资料,采用SPSS 20.0 统计软件进行分析,经检验所有数据符合正态分布且方差齐,以均数±标准差()表示。

组间比较采用单因素方差分析(one way-ANOVA),两两比较采用LSD 法,P<0.05 为差异具有统计学意义。

2.1 MTS 法筛选黄芪多糖与丹酚酸B 单用对A549细胞活性无影响的药物浓度

与空白组比较,培养48 小时后,黄芪多糖80 mg/L与丹酚酸B 80 mg/L 对A549 细胞的增殖抑制作用显著(P<0.01),见表2、3。

因此本实验选择丹酚酸B 60 mg/L 与黄芪多糖60 mg/L 进行后续实验。

表2 不同浓度黄芪多糖对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

表2 不同浓度黄芪多糖对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.05。

- 0.67±0.02 1.09±0.02黄芪多糖组 80 0.70±0.03 0.37±0.02a 60 0.60±0.01 1.05±0.02 40 0.70±0.02 1.17±0.05 20 0.67±0.02 1.25±0.02小时空白组组别 浓度(mg/L) 24 小时 48 10 0.68±0.02 1.24±0.03

2.2 MTS 法筛选黄芪多糖、丹酚酸 B 及配伍对A549 细胞活性无影响的药物浓度

与空白组比较,黄芪多糖60 mg/L、丹酚酸 B 60 mg/L及其配伍组的细胞活性无显著性差异。

见表4。

表3 不同浓度丹酚酸B 对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

表3 不同浓度丹酚酸B 对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.05。

组别 浓度(mg/L) 24 小时 48- 0.68±0.02 1.19±0.02丹酚酸 B 组 80 0.63±0.01 0.60±0.01a 60 0.88±0.02 1.50±0.10 40 0.88±0.06 1.48±0.12 20 0.80±0.05 1.40±0.09小时空白组10 0.67±0.04 1.29±0.02

表4 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

表4 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对A549 细胞增殖的影响(,n=3)

1.04±0.03 2.02±0.07黄芪多糖组 1.06±0.04 2.18±0.16丹酚酸 B 组 1.09±0.04 2.03±0.07配伍组小时空白组组别 24 小时 48 1.10±0.11 2.13±0.02

2.3 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞增殖的影响

与空白组比较,模型组在培养24、48 小时后细胞增殖出现抑制现象(P<0.01);与模型组比,培养24、48 小时后丹酚酸B 组和配伍组对细胞增殖抑制作用明显(P<0.05)。

见表5。

表5 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞增殖抑制作用(,n=3)

表5 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞增殖抑制作用(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较,cP<0.05。

1.06±0.02 2.16±0.03模型组 0.88±0.02b 1.61±0.04a黄芪多糖组 0.89±0.03 1.69±0.04丹酚酸 B 组 0.61±0.03c 1.39±0.04c配伍组 0.68±0.03c 1.20±0.17小时空白组组别 24 小时 48 c

2.4 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 和 α-SMA 的 mRNA 转录水平的影响

与空白组比较,模型组E-Cad mRNA 转录水平显著性下调(P<0.01),Vim mRNA 转录水平显著性上调(P<0.05)。

与模型组比较,黄芪多糖组、丹酚酸B 组和配伍组细胞E-Cad 的mRNA 转录水平显著性上调(P<0.01),同时三组均下调了Vim 和α-SMA mRNA 转录水平(P<0.05)。

见表 6。

表6 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA mRNA 转录水平的影响(,n=3)

表6 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA mRNA 转录水平的影响(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.05,cP<0.01。

1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.13模型组 0.35±0.08a 2.24±0.11a 1.12±0.01黄芪多糖组 0.43±0.07c 1.57±0.03b 0.95±0.03b丹酚酸 B 组 0.52±0.03c 2.08±0.05b 0.39±0.01b配伍组 0.74±0.06c 1.31±0.05b 0.52±0.06-SMA/GAPDH空白组组别 E-Cad/GAPDH Vim/GAPDH α b

2.5 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 和 α-SMA 蛋白表达量的影响

与空白组比较,模型组E-Cad 蛋白表达量显著性降低(P<0.01),Vim 和α-SMA 蛋白表达量显著性增加(P<0.01)。

与模型组比较,丹酚酸B 组和配伍组E-Cad 的表达量显著性增加(P<0.01),Vim的表达量显著性降低(P<0.01),且配伍组α-SMA表达量显著性降低(P<0.01),见图1 和表7。

图1 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 表达的影响

表7 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 蛋白表达的影响(,n=3)

表7 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 蛋白表达的影响(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.01。

0.68±0.02 0.62±0.08 0.41±0.02模型组 0.21±0.02a 1.18±0.03a 1.19±0.02a黄芪多糖组 0.19±0.02 1.23±0.04 0.83±0.06b丹酚酸 B 组 0.38±0.14b 0.88±0.02b 0.91±0.05配伍组 0.57±0.04b 0.67±0.03b 0.40±0.03空白组b-SMA/GAPDH组别 E-Cad/GAPDH Vim/GAPDH α

2.6 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞FN 和Col-I 表达量的影响

与空白组比,模型组FN 和Col-I 的表达量明显增加(P<0.05);与模型组比较,配伍组细胞FN 和Col-I 的表达量明显降低(P<0.05)。

同时,配伍组FN 和Col-I 的表达量低于黄芪多糖组(P<0.05)。见表8。

表8 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞FN 和Col-I 表达的影响(,n=3)

表8 黄芪多糖、丹酚酸B 及配伍对TGF-β1 诱导的A549 细胞FN 和Col-I 表达的影响(,n=3)

注: 与空白组比较,aP<0.05;与模型组比较,b P<0.05;与黄芪多糖组比较,cP<0.05。

组别 FN(pg/mL) Col-I(pg/mL)0.04±0.00 0.21±0.01模型组 0.09±0.00a 0.33±0.01a黄芪多糖组 0.11±0.00b 0.37±0.01丹酚酸 B 组 0.05±0.00b 0.24±0.01b配伍组 0.05±0.00bc 0.28±0.01空白组bc

在现代医学概念中,肺纤维化为一种慢性、进行性、病因尚未明确的致死性肺部疾病。

中医学将肺纤维化多归属于“肺痹”与“肺痿”等病证范畴,主要病机为气滞血瘀。

众多医家均认为,益气与活血需贯穿整个治疗过程,同时在治疗肺纤维化的高频药物分析中也显示,黄芪与丹参已经成为中医临床治疗肺纤维化的首选药对[8-10]。

黄芪味甘,性微温,归肺、脾经,具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、托毒排脓等功效。

其中黄芪多糖抗氧化能力显著,其能明显减少自由基,抑制脂质过氧化物反应,减弱气道重塑及肺泡损伤发生的可能性[11],并能通过调控与肺纤维化凋亡相关通路例如Bax 及Bcl-2 信号途径蛋白表达量和抑制非Smad/TGF-β1 信号通路来干预肺纤维化的发生[12-13]。

丹参因具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的作用,被《神农本草经》列为上品[14]。

相关研究显示,丹参有效成分都可以延缓大鼠肺泡炎与肺纤维化的进程,并能下调大鼠肺组织TGF-β1 的蛋白表达水平与羟脯氨酸的含量,同时还可进一步通过调控Smad/TGF-β1 信号转导通路,影响机体氧化/抗氧化的平衡,起到防治肺纤维化的作用[15-20]。

与此同时,本课题组前期研究发现,与黄芪和丹参的有效成分单用组相比,黄芪多糖与丹酚酸B 配伍组对博来霉素所致大鼠肺纤维化模型的改善效果更优,且在细胞水平进行的丹酚酸A、丹参酮ⅡA 和丹参素进行比较研究中,也发现丹酚酸B 通过调节TGF-β1 诱导的A549细胞的存活率、FN、Col-I 和E-Cad 等代表性指标,产生抑制EMT 的作用[6]。

因此本实验基于前期基础上选择黄芪多糖配伍丹酚酸B,从益气活血角度进行体外实验。

肺纤维化是一个复杂的病理过程,特征主要为肺上皮细胞严重损伤,(肌)成纤维化细胞增殖和异常的胶原沉积所导致的损伤过度修复。

其中,肺上皮细胞的损伤和功能障碍是启动肺纤维化的核心。当肺上皮细胞持续损伤时,精疲力竭的Ⅱ型肺泡上皮细胞无法向Ⅰ型肺泡上皮细胞转化,有可能引起EMT 的上游信号通路的激活,进而导致(肌)成纤维细胞的积累以及细胞外基质的沉积,产生纤维化灶[21]。

同时,ECM 作为由分泌蛋白相互连接而形成的动态支架,始终在进行重塑,以此来维持组织损伤修复与稳态[22]。

α-SMA 作为平滑肌细胞收缩结构的基础,主要分布于血管平滑肌与肌上皮细胞中,其可反映平滑肌的数量与收缩能力。

Vim 则为一种重要的细胞骨架蛋白,在发生肺纤维化时表达量增加[23]。

上皮细胞特异性表型的跨膜粘附受体E-Cad 可作为EMT 过程中上皮细胞的标志物。

在肺纤维化过程中,纤维化程度越高,E-Cad 表达量越低[24]。

FN 为一种二聚糖蛋白,是成纤维细胞主要的趋化因子与活化因子,当FN 表达量增加时,会引发趋化细胞迁移,并使纤维化细胞发生聚集[25]。

胶原作为ECM 的重要成分之一,当EMT 发生时,胶原合成和降解的平衡遭到破坏,COL-I 表达增加导致ECM 沉积,因此COL-I 对维持肺的扩张性程度起着决定性的作用[26]。

在氧化应激、炎性因子和细胞因子尤其是TGF-β1 的刺激下,肺泡上皮细胞逐渐失去紧密连接以及上皮E-Cad,获得α-SMA 和Vim 等(肌)成纤维细胞特异性蛋白,并沿着新分泌的ECM的代表性组成成分 FN 与 COL-I 迁移。

因此,α-SMA、Vim、E-Cad、FN、COL-I 的表达异常是畸形激活EMT 的关键指标[27]。

本研究结果显示,实验药物能下调α-SMA、Vim基因与蛋白的表达,上调E-Cad 的表达,且黄芪多糖与丹酚酸B 配伍组效果优于单用组。

同时,黄芪多糖与丹酚酸B 配伍后可抑制ECM 成分FN、COL-I的表达,结果表明黄芪—丹参组分配伍能一定程度抑制TGF-β1 的刺激下肺泡上皮细胞的EMT 进程,从而削弱肺纤维化程度,这些作用机制的揭示为指导临床用药提供了可靠的药理学依据,但其作用与机制仍有待进一步深入探讨。