补充维生素D对非酒精性脂肪肝病患者肠道菌群的影响

韩源平 徐思雅† 蒋希乐

（1.四川大学生命科学学院，四川 成都 610065；
2.四川大学华西医院，四川 成都 610041）

非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是目前最为常见的一种慢性肝病，它是一种与胰岛素抵抗、遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）、肝硬化（Cirrhosis）和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）［1-2］。NAFLD近年来在全球的患病率不断上升，约占全球人口的25.2%［3］。目前我国已有超过2.4亿NAFLD患者［4］，有预测分析认为，中国将成为全球NAFLD患病率增长最快的国家，到2030年患病人数将突破3.1亿［5］。目前对于NAFLD的治疗主要从降脂、保肝及抗氧化切入，尚无针对NAFLD的特效药物，可以预见未来NAFLD将成为全球公共卫生的一个重大挑战［6-7］。

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MetS）被认为是NAFLD最重要的风险因素，包括胰岛素抵抗、肥胖、血脂异常和高血压等，与NAFLD发病密切相关，同时NAFLD也会促进MetS进一步发展，从而引发心血管疾病［1，6］。NAFLD发病机制复杂，传统观点认为NAFLD发病主要来源于“二次打击”，“首次打击”为胰岛素抵抗，导致甘油三酯代谢异常，引发肝脏脂肪堆积，肝脏代谢功能受损，从而导致肝脏脂肪变性，同时增加了肝脏对外界刺激的易感性；
“第二次打击”则为氧化应激，进一步加剧肝损伤，伴随肝脏炎症与肝纤维化［8］。随着研究的深入，NAFLD被认为是由多种致病因素共同作用而引发，包括脂质过氧化、线粒体功能障碍、内质网应激、肠道菌群失调等［9］。

近年来，越来越多的研究表明肠道菌群通过“肠-肝轴”参与了NAFLD的发生发展［10］。长期高脂饮食会引起肠道通透性增加，肠道菌群组成改变，导致血清内毒素、内源性乙醇水平升高，促炎因子水平上升，进而促进肝脏炎症及纤维化进程［11］。借助于动物模型，研究发现肠道菌群能通过影响代谢进程、免疫功能参与NAFLD的进展［10］，包括肝脏炎症、内毒素血症、肥胖症、胆碱代谢紊乱等［12］。此外，已有临床研究揭示了NAFLD患者相比健康人群肠道菌群的异常表现，如菌群多样性降低，特定菌相对丰度水平显著变化等［13-15］。

维生素D（VD）缺乏已被证实与NAFLD密切相关［16-17］，NAFLD患者的血清25（OH）D水平显著低于健康人群［18］，VD缺乏现象在NAFLD患者中相比健康人群多26%［19］。笔者所在课题组通过前期动物实验，证明了VD缺乏会加重高脂饮食引起的肝脂肪变性和代谢紊乱［20］，并且VD缺乏会促进炎症反应，导致肠道菌群的紊乱，在临床试验中也得到了印证［21］。此外，已有研究报道，补充VD能调节肠道菌群［22-23］，提高健康人体肠道菌群的多样性［24］。然而目前关于补充VD对于NAFLD患者肠道菌群的临床作用研究较少。本研究借助高通量测序及生物信息学分析方法，开展随机对照临床试验，评估补充VD对于NAFLD患者肠道菌群的影响，从而为今后探索通过补充VD调节肠道菌群，进而缓解NAFLD提供参考。

1.1 研究对象

本研究为随机对照临床试验，于2018年8月至2020年1月在成都市公共卫生临床医疗中心，共入组29例NAFLD患者。本次临床试验已在中国临床试验注册中心进行注册，注册号为ChiCTR1800017-879。本次研究方案已获成都市公共卫生与临床中心医学伦理委员会批准（#2018Y001）。

纳入标准：（1）年龄介于18到60岁之间；
（2）符合中国《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》（2018版），通过腹部彩超检查或CT、MRI检查显示为脂肪肝；
（3）丙氨酸氨基转移酶（ALT）≥正常上限的2倍（80 U/L）或谷氨酰转肽酶（GGT）≥正常上限的1.5倍（75 U/L）；
（4）过往没有饮酒史或饮酒折合乙醇量小于140 g/周（女性小于70 g/周）；
（5）HBsAg（+）或者HCV-RNA（+）；
（6）血清钙、磷正常；
（7）签署知情同意书，自愿参加本研究者。

排除标准：（1）患有其它严重疾病；
（2）抗HIV阳性者；
（3）哺乳或妊娠期妇女；
（4）过往具有不健康饮酒史（饮酒折合乙醇量男性大于140 g/周，女性大于70 g/周）；
（5）药物滥用者；
（6）过去6个月有服用VD史；
（7）纳入研究前3个月体重下降超过5%；
（8）酒精性肝病；
（9）其它药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病；
（10）合并其他严重的全身性疾病和精神病患者；
（11）依从性差，不能保证按本研究完成研究者。

在入组开展试验之前，本次试验研究对象均对治疗及采样流程进行了详细了解，并签署了知情同意书。

1.2 分组与干预

本次试验目的是为了探索补充VD对NAFLD的缓解作用，采取了在内科治疗的基础上，以肌肉注射的方式，给NAFLD患者补充VD。

所有受试者随机分成对照组和VD组：对照组15例，治疗期间只进行内科治疗，即1日1次给患者静脉注射多烯磷脂酰胆碱注射液（天兴，成都天台山制药有限公司）10 mL，1日1次复方二氯醋酸二异丙胺（雅普宜，海南灵康制药有限公司）80 mg；
VD组14例，治疗期间在内科治疗的基础上，肌肉注射维生素D2注射液（华润双鹤药业股份有限公司），将入组时间计为第0天，一次性补充60万单位维生素D2。为保证用量安全，注射剂量严格参照中国药典剂量标准以及维生素D2注射液说明书用法用量指示。

30天后对患者进行血液生化全套检查（日立全自动生化分析仪7600型），包括肝功、肾功、血脂、血糖等指标，测定患者血清25（OH）D浓度（25-羟基维生素D ELISA试剂盒，英国艾狄斯公司），并且对患者粪便进行取样。详细检查指标包括ALT、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、GGT、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、总胆汁酸（TBA）、尿素（UREA）、肌酐（CR）、尿酸（UA），血钙（CA）、血磷（P）、血糖（GLU）、胰岛素（INS）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

1.3 粪便DNA提取及检测

采集入组研究对象的粪便样本时，取0.25 g新鲜粪便样本保存于1.5 mL无菌离心管中，采集后的样本立即置于冰上，之后转移至-80℃冰箱保存待用。提取粪便样本DNA按照QIAamp®PowerFecal® DNA Kit（50）试剂盒的操作步骤进行，完成后将粪便DNA交由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rRNA测序分析（Ion S5TMXL高通量测序）。

1.4 统计分析

组间临床指标基线水平、肠道菌群变化趋势的比较，采用Mann-WhitneyU检验、独立样本t检验；
组内治疗前后肠道菌群变化的比较，采用Wilcoxon秩和检验、配对样本t检验；
对组内、组间治疗前后进行聚类差异比较，采用Adonis（非参数多因素方差分析）检验；
生化指标与肠道菌群特定菌类之间的关联性分析采用Spearman相关性分析。计量资料以平均值±标准差表示。以上统计检验均由GraphPad Prism（Version 6.01，USA）软件进行计算，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.1 受试者基本资料

本研究从完成试验NAFLD患者中随机选取29例患者的粪便样本，进行了肠道菌群16S rRNA测序。其中对照组15例，包含男性9例，女性6例，平均（36.50±1.97）岁；
VD组14例，包含男性10例，女性4例，平均（35.00±2.67）岁；
两组研究对象性别、年龄比较均无显著差异（P＞0.05）。测序完成后，对两组患者的肠道菌群变化进行了细致分析。

2.2 NAFLD患者在治疗期间，25（OH）D水平的变化情况

为了保证肌肉注射维生素D2的有效性，本研究测定了两组患者在治疗前后血清25（OH）D水平，发现在对照组和VD组患者中，25（OH）D的基线水平无显著差异（P＞0.05），基本在25～75 nmol/L之间，即处于不足（50～75 nmol/L，占51.7%）或缺乏（小于50 nmol/L，占44.8%）的状态，充足仅占3.4%（VD组有一位患者的25（OH）D为91.13 nmol/L）。治疗后，对照组患者的25（OH）D未发生显著变化（P＞0.05），而VD组患者的25（OH）D水平出现显著升高（P＜0.05）。组间比较，治疗后VD组25（OH）D水平明显高于对照组（P＜0.01）。证实了补充维生素D2能有效提高NAFLD患者的血清25（OH）D水平，具体见表1。

表1 NAFLD患者血清25（OH）D均值在治疗期间的变化水平Table 1 Mean serum 25（OH）D levels in NAFLD patients during the clinical treatment nmol/L

2.3 NAFLD患者在治疗期间，血清生化指标的变化情况

为了评判VD对NAFLD的治疗效果，本研究测定了血清生化指标。部分指标在两组患者的组内、组间出现显著变化。组内比较显示：VD组的ALT显著下降（P＜0.001），TP显著上升（P＜0.05），ALB显著上升（P＜0.01），CA显著上升（P＜0.05），AST有显著下降的趋势（P=0.08）；
而对照组的GLO在治疗后出现显著上升（P＜0.05），P显著下降（P＜0.01）。组间比较显示：治疗前生化指标无显著差异（P＞0.05），治疗后VD组ALB（P＜0.05）、UREA（P＜0.05）显著高于对照组，HDL-C显著低于对照组（P＜0.01），具体见表2。

表2 NAFLD患者在治疗期间生化指标均值的变化情况Table 2 Variation of mean biochemistry index in NAFLD patients during the clinical treatment

2.4 NAFLD患者肠道菌群OTU分布

根据维恩图所示，两组NAFLD患者治疗前后共检出808个OTU，对照组第0天有624个，第30天有635个，VD组第0天有605个，第30天有617个。采用相似度在97%以上的OTU进行分析，组内比较OTU共有数量，对照组第0天、30天共有572个，VD组第0天、30天共有531个；
组间比较OUT共有数量，对照组第0天、VD组第0天共有491个，对照组第30天、VD组第30天共有502个。对照组、VD组经过治疗，肠道菌群结构均发生了变化，具体见图1。

图1 NAFLD患者治疗前后肠道菌群的维恩图Fig.1 Venn diagram of gut microbiota in NAFLD patients during the clinical treatment

2.5 VD对于NAFLD患者肠道菌群多样性的影响

为了观察VD治疗后，NAFLD患者肠道菌群的群落构成变化，本研究分析了两组患者肠道菌群中的α多样性和β多样性。得到了两组患者肠道菌群多样性的统计平均值。

在分析α多样性时，本研究选取了菌群丰度指数Chao1指数、ACE指数，以及多样性指数香农指数（Shannon Index）、辛普森指数（Simpson Index）作为判别指标。两组患者在治疗前后组内、组间均无显著差异（P＞0.05）。见表3。

表3 NAFLD患者的肠道菌群α多样性指数Table 3 Alpha-diversity of gut microbiota in NAFLD patients

接着，本研究对两组患者肠道菌群的总体构成β多样性进行了分析，基于Unweighted UniFrac（以物种间的遗传序列信息为参考，只考虑物种有无，不考虑物种丰度高低）算法，进行了主坐标分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA）。结果发现以PC1（16.42%）、PC2（7.42%）为主坐标，组内比较，VD组、对照组在治疗前后，肠道菌群的聚类均没有显著变化；
组间比较，在治疗前后，VD组的聚类与对照组均存在显著差异（P＜0.01）。具体见图2。

图2 NAFLD患者的肠道菌群β多样性指数在治疗前后的变化Fig.2 Altered beta-diversity of microbiota in NAFLD patients during the clinical treatment

2.6 VD对于NAFLD患者肠道菌群丰度的影响

本研究比较了两组患者治疗前后肠道菌群在门、科、属水平上的丰度变化，其中在门水平上，丰度最高的菌依次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁杆菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae）、蓝菌门（Cyanobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、黑水仙菌门（Melainabacteria）、未命名细菌（unidentified_Bacteria），这些菌门的丰度在两组患者治疗期间均无显著变化（P＞0.05）。见图3。

图3 NAFLD患者门水平上排名前10的物种Fig.3 Top 10 abundant taxa at phylum levels of gut microbiota in NAFLD patients

在科水平上，两组患者肠道菌群丰度排名前10位的菌依次为拟杆菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、韦荣氏菌科（Veillonellaceae）、文肯菌科（Rikenellaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、坦纳菌科（Tannerellaceae）、梭杆菌科（Fusobacteriaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）。组内比较，在VD组患者中，毛螺菌科相对丰度水平治疗后显著降低（P＜0.01），丹毒丝菌科显著升高（P＜0.01），而在对照组中无明显变化（P＞0.05）。并且组间比较，治疗前，毛螺菌科在两组间无显著差异（P＞0.05），治疗后，VD组毛螺菌科相对丰度水平显著低于对照组（P＜0.001），组间丹毒丝菌科在治疗前后均无显著差异（P＞0.05）。见表4。

表4 NAFLD患者科水平上排名前10的物种Table 4 Top 10 abundant taxa at family levels of gut microbiota in NAFLD patients

在属水平上，两组患者肠道菌群丰度排名前10位的菌依次为拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、巨单胞菌属（Megamonas）、毛螺菌属（Lachnospira）、罗氏菌属（Roseburia）、普雷沃氏菌科未命名属（unidentified_Prevotellaceae）、另枝菌属（Alistipes）、链球菌属（Streptococcus）、小杆菌属（Dialister）、丹毒丝菌科未命名属（unidentified_Erysipelotrichaceae）。组内比较，在VD组患者中，丹毒丝菌科未命名属相对丰度水平在治疗后显著升高（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05）。见表5。

表5 NAFLD患者属水平上排名前10的物种Table 5 Top 10 abundant taxa at genus levels of gut microbiota in NAFLD patients

2.7 肠道菌群与血清生化指标的相关性分析

Spearman相关性分析常被运用在肠道菌群与血清代谢产物关联分析（Association Analysis）中［25］。本研究发现NAFLD患者中的部分肠道菌与血清生化指标具有一定相关性。

在本研究中，VD组患者中厚壁杆菌门、毛螺菌科与TG呈中等程度正相关（厚壁杆菌：r=0.584，P＜0.01；
毛螺菌科：r=0.404，P＜0.05），而对照组则无显著关联。见图4（a）-图4（d）。此外，两组患者中丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属均与ALT、AST呈显著负相关，但两种菌在科、属水平在VD组表现出与25（OH）D水平呈显著正相关（丹毒丝菌科：r=0.452，P＜0.05；
丹毒丝菌科未命名属：r=0.600，P＜0.001），而在对照组则无显著关联，并且VD组中两种菌在科、属水平与ALT、AST呈强负相关，且相关性强于对照组。见图4（e）-图4（p）。

图4 NAFLD患者肠道菌群与血清生化指标的相关性分析Fig.4 Association analysis of gut microbiota in NAFLD patients with serum metabolites

VD是人体必需的营养元素，日光照射是人体合成VD的重要途径。随着城市化进程加快以及生活方式的改变，居民户外运动时间日趋减少，VD缺乏人群越来越多。根据一项我国成年人群VD情况调查，多数地区VD缺乏发生率高于60%，VD缺乏已成为我国居民面临的重要问题［26-27］。根据中国居民膳食营养素参考摄入量建议，成人推荐VD摄入量为400 IU/d，为了预防VD缺乏，日常可多晒太阳、多吃富含VD的食物如深海鱼、肝脏、蘑菇等，必要时可在医生建议下使用VD补充剂［28］。VD缺乏被认为与NAFLD有关［16-17］。本研究参照内分泌协会指南，将血清25（OH）D小于50 nmol/L定义为VD缺乏、50～75nmol/L为不足、大于75nmol/L为充足［29］。入组患者几乎都处于VD不足或缺乏状态（不足51.7%，缺乏44.8%，充足3.4%），这也暗示我们VD缺乏可能与NAFLD有着密切的联系。

转氨酶是反映肝损伤程度的重要标志，转氨酶水平高是NAFLD在临床上的重要表现。本研究发现，VD组患者在治疗前ALT值为（132.10±13.66）U/L、AST值为（60.14±7.73）U/L，两者水平远超出正常范围0～40 U/L，补充VD之后，VD组患者血清ALT、AST水平均出现降低，且ALT显著降低，AST呈现下降的趋势，说明VD对于改善肝损伤有一定的效果，这与之前的报道是一致的［30-31］。本研究同样发现VD组经过治疗后，CA浓度显著上升，并处于正常范围2.25～2.75mmol/L，体现出VD促进钙吸收的作用；
TP、ALB出现显著上升，治疗后UREA显著高于对照组，HDL-C显著低于对照组，但都属于正常范围之内的波动（正常值范围：TP，60～80g/L；
ALB，35～50g/L；
UREA，4.52～4.96mmol/L；
HDL-C，2～3.6mmol/L）。

笔者所在课题组前期研究发现，VD受体（Vitamin D Receptor，VDR）在小肠潘氏细胞中大量表达，后者是小肠重要的先天免疫细胞，VD信号通过VDR可上调机体先天免疫［20，32-33］。因此，给予NAFLD患者高剂量的VD，也可能通过调节小肠的先天免疫系统，包括防御肽的表达，平衡肠道菌群，进而缓解NAFLD。本次随机对照临床试验初步探索了NAFLD患者补充高剂量VD后肠道菌群的变化情况，观察指标包含肠道菌群多样性、丰度、肠道菌群与血清生化指标相关性。在本次试验中，VD对于NAFLD患者肠道菌群多样性，包括α多样性和β多样性，未观察到显著影响。但是，本研究发现VD能够调节特定菌的丰度，这些菌与血脂、肝损伤密切相关。

Spearman相关性分析结果提示肠道菌与部分生化指标存在一定相关性。本研究发现经过VD治疗的NAFLD患者，厚壁杆菌门、毛螺菌科与TG呈现中等显著正相关性，而对照组则无该现象。目前已知，毛螺菌是一类与肥胖相关的菌。此前有研究报道，从高血糖肥胖小鼠粪便中分离毛螺菌科下的菌株（AJ110941），移植给ob/ob肥胖易感小鼠，小鼠出现了肝脂肪变性，血糖显著升高，以及胰岛素、HOMA-β显著降低［34］，揭示了毛螺菌可能导致肥胖、高血糖。高脂饮食会增加毛螺菌数量［35］，根据已有研究，缺乏VD饮食导致小鼠中毛螺菌数量增加，提示毛螺菌可能与VD呈现负相关性［23］。在本研究中，VD治疗能够显著降低与肥胖相关的毛螺菌科相对丰度水平，可能从调节血脂的角度，缓解NAFLD。

此外，本研究发现补充VD后，患者丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属与血清25（OH）D水平呈显著正相关，而与ALT、AST呈中等或强负相关；
没有VD治疗情况下，丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属与血清25（OH）D水平无显著相关性，虽然与ALT、AST呈现显著中等负相关，但关联性相比VD治疗组较弱。目前在NAFLD中关于丹毒丝菌科的报道甚少，现有的几乎都来源于动物实验结果。有研究报道高脂、高糖饮食诱导的NASH小鼠相比正常饮食小鼠丹毒丝菌科水平升高［36］；
另外一项研究报道肝实质细胞中的核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（Nucleotide-binding Oligomerization Domain-Containing，NOD2）能够抑制肝脂肪变性、肝纤维化以及肠道菌群失调，而经过NAFLD饮食诱导的肝实质细胞特异性敲除Nod2-/-的小鼠中丹毒丝菌科显著降低，说明丹毒丝菌科与NAFLD可能呈负相关［37］。此外，目前几乎没有针对丹毒丝菌科与肝损伤指标方面的相关研究。而在本研究中，VD不但与丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属呈现显著正相关，并且能够显著升高丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属相对丰度水平。这一现象提示我们丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属可能在VD治疗NAFLD过程中扮演着重要角色，并从减轻肝损伤的角度，缓解NAFLD。

人体的肠道菌群是庞大又复杂的，他们与免疫调节、代谢、维生素合成等生理功能息息相关，可以说是人体的又一个“器官”。尽管肠道菌群对人体健康十分重要，但不可否认的是，目前对于“健康肠道菌群”尚无确切的定义。目前已经有很多临床试验探讨了VD对于肠道菌群的影响，其中涉及了健康人群以及各类疾病患者［24］。VD对于肠道菌群存在一定影响，这点是可以确定的。并且VD的补充也不拘泥于形式，可以是口服、静脉注射，甚至通过照射NB-UVB来补充［38］。但是这些试验在结果的判定上都是定性的，而非定量的。不同于动物实验，临床试验难以控制，尤其是人体肠道菌群受多种可能因素的影响，如年龄、饮食、运动等等，这些因素可以归结为个体的差异。由于患者个体差异较大，本研究在组内、组间比较相结合的基础上，强化了组内比较，即关注NAFLD患者自身在治疗前后的变化。以此次试验为VD对于NAFLD患者肠道菌群的影响定论为时尚早，后续可延长VD干预疗程、增大样本量来进一步探索NAFLD患者肠道菌群对于VD的应答，并深入挖掘特定类群及其代谢途径，对VD作用机制加以解释。

综上所述，基于目前小规模的临床试验，本研究发现补充VD对于调节NAFLD患者肠道菌群、改善肝功能具有一定程度的积极影响。补充高剂量VD后，能够一定程度改善肝损伤程度，显著降低肝功指标ALT，能够降低NAFLD患者“肥胖菌”毛螺菌科的丰度，毛螺菌科与TG呈现显著正相关，并且能够提高25（OH）D相关菌丹毒丝菌科、丹毒丝菌科未命名属的丰度，而这两类菌与反映肝功能损伤的ALT、AST呈现显著负相关。