羟基红花黄色素A通过抑制程序性坏死减轻小鼠重症中暑引起的急性肺损伤

柳晓峰，张 爽，余让辉，林晓萍，樊文浩，王玉晶，梁志立，谢维当，刘亚楠，陈 辉

1南方医科大学南方医院重症医学科，广东 广州 510515；
2江门市中心医院重症医学科，广东 江门 529000

由于人为气候变化，全球范围内严重热浪的频率有所增加，重症中暑作为一种重症热相关疾病引起了全球卫生系统和社会层面的广泛关注［1］。重症中暑（sHS）常合并多器官功能衰竭综合征（MODS），死亡率高［2,3］。重症中暑并发MODS最常见的是急性肺损伤（ALI）造成的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），重症中暑引起急性肺损伤其发病机制尚不完全清楚［4］。程序性坏死为新发现的一种细胞死亡类型，同细胞凋亡一样受细胞内信号途径的调控，我们团队前期研究结果表明热打击可导致肺微血管内皮细胞发生程序性坏死，从而导致急性肺损伤发生及发展［5］。

羟基红花黄色素A（HSYA），HSYA是红花黄色素的主要成分，一系列的研究表明HSYA具有心肌、脑、内皮保护作用、抗氧化应激、抗炎、抗肝纤维化活性及抗肿瘤特性［6,7］，最近研究表明，HSYA可通过阻断凋亡和自噬在重症中暑中起神经保护作用［8］，然而HSYA在重症中暑肺损伤症中作用尚未有研究报道。本研究进一步明确了程序性坏死在重症中暑肺损伤发生发展中的作用和地位，探讨使用HSYA药物治疗是否可阻断程序性坏死的发生从而有效改善急性肺损伤，更有助于揭示HSYA治疗重症中暑急性肺损伤的作用和机制，为临床开展HSYA治疗重症中暑奠定理论基础。

1.1 实验材料及试剂

SPF级雄性6～8周龄C57BL/6J小鼠160只，购自南方医科大学实验动物中心，清洁动物房中饲养，所有动物实验过程符合中国及南方医院关于实验动物及福利的制度（伦理编号：NFYY-2019-176）。HSYA（上海莫奇生物科技有限公司），Nec-1(Sigma)，RIP1、RIP3、MLKL-s358、MLKL 及GAPDH 抗体（Cell Signaling Technology），Elisa试剂盒（Roche）。

1.2 重症中暑小鼠模型的建立、热适应及预后观察

1.2.1 动物准备及分组 成年雄性C57BL/6小鼠，饲养环境温度22±1 ℃，12 h明暗循环，自由饮食饮水。根据实验设计具体分组如下：（1）重症中暑小鼠造模前，分别以不同剂量HSYA腹腔内注射（1.125、2.25、4.5 mg/kg）分别处理5 d，分为低，中和高剂量HSYA中暑组，单纯中暑（HS）及正常对照（control）组，给予生理盐水腹腔注射分别处理5 d，12只/组；
（2）确定HSYA中剂量组为最佳治疗剂量后，与Nec-1预处理组进行比较，具体分组为：HSYA 中剂量组（2.25 mg/kg），Nec-1 预处理组（1 mg/kg），腹腔注射分别处理5 d，然后进行热打击，单纯中暑组及正常对照组给予生理盐水腹腔注射处理5 d，8只/组。

1.2.2 适应性训练 为了减少环境改变对小鼠造成的应激影响，实验前进行适应性训练，为期2周，实验前3 d停止适应性训练。适应性训练内容：（1）直肠热电偶，内容：将连接生理记录仪的直肠热电偶置入直肠内，插入深度3 cm，留置2 min，1次/d；
（2）人工热气候模拟舱，内容：将实验小鼠连同鼠笼置于人工热气候模拟舱中，设置舱内温度为23 ℃，湿度（55±5）%，8 h/d。

1.2.3 重症中暑小鼠模型 实验前20 min称重，开始禁食、禁水，人工热气候模拟舱预热至30 ℃。热打击方法是将小鼠置于预热至30 ℃的人工热气候模拟舱，在30 min内将舱内温度逐渐增加至39±0.5 ℃，相对湿度（65±5）%。监测直肠温度，使用直肠热电偶测量系统，频率为10 min/次。重症中暑诊断标准［9］：核心体温达到42.7 ℃，维持时间超过1 min。达到重症中暑诊断标准后，将小鼠移出人工热气候模拟舱，接受20 min全身降温治疗（酒精擦浴和喂食20 ℃冷水20 mL），继续按照10 min/次的频率监测直肠温度，直至恢复期72 h。对照组小鼠与重症中暑组小鼠接受同步处理，不同的是对照组小鼠全程置于23 ℃和55%相对湿度的环境中。

1.2.4 评估各组热耐受情况并观察小鼠预后 参照文献［9］计算热打击过程中热负荷、脱水量、到达最高核心体温时间、热打击结束后到达低体温时间及低体温持续时间评估各组动物热耐受情况。根据实验目的不同，观察预后的实验组小鼠设置的实验终止点是热打击后3 d。

1.3 标本的采集

实验动物的准备和模型的构建同前述，分组为：正常对照组，热打击组，HSYA预处理组及Nec-1预处理组，正常对照组6只，其余18只/组。

（1）分组分别于HS恢复期0、2、6、12、24 h时间点取出小鼠，其中2 h时间点取出6只，其中3只用于后续肺泡灌洗液测定，其余时间点均取出3只小鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，然后左心室穿刺采集血液样本，剖取肺组织样本；
（2）常规方法分离血清，置于-80 ℃冻存；
（3）肺组织组织样本分两部分，一部分4%甲醛溶液（40%甲醛溶液，灭菌注射用水按1∶9稀释）中固定，另一部分置液氮中冻存。

1.3.1 血清样本指标检测 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、HMGB1的浓度。

1.3.2 肺组织病理学检查 石蜡组织样本切片，厚度3 μm，按常规方法进行HE染色。采用双盲法，由两名病理医生阅片，评分。

1.3.3 BALF中蛋白含量、白细胞计数、中性粒细胞计数、肺湿/干重比值、肺含水量及HMGB1的测定 各组小鼠于造模后2 h经腹腔注射水合氯醛麻醉后，采集支气管肺泡灌洗液（BALF），方法参照文献［10］。取上述肺泡灌洗液离心后的上清液，用BCA 法测定蛋白含量。在沉淀中加入200µL红细胞裂解液，1 min后加入1 mL预冷的PBS，4 ℃，1200 r/min离心10 min；
弃上清，用1 mL预冷的PBS重悬细胞沉淀，取10µL进行白细胞计数，余液再次4 ℃，1200 r/min离心10 min。根据白细胞计数结果决定需要残留多少上清重悬细胞沉淀（白细胞计数为106/mL可用100µL上清液重悬后涂片3～5张），弃余上清，细胞悬液用于涂片（根据细胞总数决定涂片张数）；
涂片后待玻片自然晾干，然后置于4%多聚甲醛溶液中固定10 min，随后进行瑞氏染色；
在玻片标本区域滴加瑞氏染色液4～8滴，将标本完全盖住；
1～2 min后，滴加适量缓冲液（染液与缓冲液比例约为1：1.5），以注射器抽气向玻片上轻轻打气使染液和缓冲液混合均匀；
10～15 min后用自来水冲洗，切忌水力过大，以流水滴入使染液及缓冲液自玻片边缘溢出；
晾干，光镜下分类计数，镜下计数300个以上细胞，求出中性粒细胞百分比，白细胞总数与百分比相乘，得出中性粒细胞的绝对计数值。上述支气管肺泡灌洗结束后，离断右肺，取右上、中肺，小心剔除肺外组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干肺表面液体，立即置于电子天枰上称湿重，后放入60 ℃烘箱内烘干48 h至恒重，称重记下数值为干重，并计算肺组织湿重/干重比值及肺含水量[（肺湿质量－肺干质量）/肺湿质量]。ELISA 法检测肺泡灌洗液中HMGB1的浓度。

1.3.4 Western blotting 检测RIP1、RIP3 及MLKL 蛋白表达及磷酸化水平 取出液氮中肺组织进行碾磨，蛋白定量及Western blotting具体步骤参照文献［10］。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示，生存率估计用Kaplan-Meier法，生存曲线比较用Log-rank法，多组数据比较采用应用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 不同浓度HSYA预处理对重症中暑小鼠热耐受的影响

成功建立中暑动物模型，并初步观察不同浓度HSYA预处理对重症中暑小鼠热耐受的影响，到达最高核心体温、低体温时间、低体温深度、低体温持续时间、热负荷及严重热负荷为评价小鼠热耐受程度的指标，给予中剂量及高剂量HSYA预处理可明显改善小鼠热耐受能力，中剂量与高剂量无显著差异（表1），故后续药物预处理以中剂量（2.25 mg/kg）作为标准剂量。

表1 不同浓度HSYA预处理重度中暑小鼠核心体温调节特征Table 1 Characteristics of core thermoregulation in severe heatstroke mice pretreated with different concentrations of HSYA(n=60)

2.2 HSYA及Nec-1预处理HS小鼠热应激及恢复期Tc调节特征

HS组小鼠在热暴露期间，核心体温呈三相式上升，表现为初始阶段核心体温快速上升，随后表现为类似于平台的缓升期，缓升期持续较长时间，此后进入快速上升期，直至达到重症中暑（42.7 ℃）诊断标准，后将小鼠转移至室温（23 ℃）。热打击各个时段，HS 组、HSYA+HS组及Nec-1+HS组小鼠核心体温与对照组有显著差异（P＜0.05）。恢复期，HS组及HSYA+HS组小鼠从舱内拿出后体温降低，体温低于36 ℃，定义为中暑后低体温，如表2所示与HS组相比，HSYA+HS组和Nec-1+HS组小鼠到达低体温的时间，其热暴露时间、到达低体温时间、低体温的深度和低体温持续时间均存在显著差异，HSYA+HS组和Nec-1+HS组无明显差异（图1）。

表2 HSYA及Nec-1预处理重度中暑小鼠核心体温调节特征Table 2 Characteristics of core thermoregulation in severe heatstroke mice pretreated with HSYAand Nec-1(n=32)

图1 各组小鼠在热打击过程中及恢复期核心体温特征Fig.1 Characteristics of core temperature of the mice in each group during heat shock and recovery period.

2.3 HSYA及nec-1预处理对中暑小鼠预后及炎症水平影响

HSYA及Nec-1预处理小鼠可显著增加中暑小鼠72 h生存率，中暑小鼠恢复期2 h血清中TNF-α、IL-6及HMGB1水平明显升高，给予HSYA及Nec-1预处理可明显降低中暑恢复期2 hIL-6及HMGB1水平，HSYA可明显降低中暑恢复期2 h血清中TNF-α水平，Nec-1预处理组与对照组相比无显著差异（图2）。

图2 HSYA药物及nec-1干预对重症中暑小鼠72 h生存率及血中TNF-α、IL-6及HMGB1水平的影响Fig.2 Effects of HSYA and Nec-1 intervention on 72-h survival rate and serum levels of TNF-α,IL-6 and HMGB1 of the mice with severe heat stroke.A:Effects of HSYA and Nec-1 on survival rate of severe heat stroke mice.B-D:Serum levels of TNF-α,IL-6 and HMGB1 detected at 0,2,6,12,and 24 h during the recovery period using ELISA,respectively.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 HSYA+HS，nec-1+HS group vs HS group，ns:no significant difference).

2.4 HSYA及Nec-1可改善重症中暑导致的急性肺损伤

对照组小鼠肺泡结构正常，肺泡壁薄，肺泡腔内无炎性细胞浸润；
而重症中暑组肺泡上皮细胞肿胀，肺泡壁明显增厚，肺泡腔内大量渗出液，毛细血管扩张充血、出血，间质水肿，组织内灶状、片状炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，严重者见大片肺泡萎陷不张及肺泡断裂；
HSYA及Nec-1预处理重症中暑组肺泡结构有所改善，肺泡间隔略有增宽，肺泡壁增厚有一定程度减轻，肺泡腔清晰，炎性细胞浸润程度较重症中暑组明显减轻（图3A）；
HSYA及nec-1预处理降低重症中暑小鼠肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞计数、蛋白含量、肺水、肺湿干重比及HMGB1水平（图3B、C）。

图3 HSYA药物干预对重症中暑肺损伤的影响Fig.3 Effect of HSYA intervention on severe heatstroke-induced lung injury in mice.A: HE staining of the lung tissues collected at 2 h during the recovery period(Original magnification:×200).B: Counts of white blood cells and neutrophils and total protein contents in bronchoalveolar lavage fluid and lung water content and lung wet/dry weight ratio at 2 h during recovery.C:HMGB1 levels in the bronchoalveolar lavage fluid at 2 h.*P＜0.05,**P＜0.01 HSYA-HS group,Nec-1-HS group vs HS group.

2.5 重症中暑小鼠肺组织发生程序性坏死及HSYA对程序性坏死的作用

中暑小鼠恢复期2 h肺组织中RIP1及MLKL磷酸化水平升高，并持续至恢复期12 h，RIP3表达未见明显改变，MLKL水平于中暑恢复期6～12 h降低，MLKL-s358磷酸化水平中暑后2 h升高并持续至12 h（图4A）。与HS组相比，HSYA+HS组MLKL-s358磷酸化水平降低（P＜0.05，图4B）。

图4 HSYA药物预对重症中暑小鼠肺组织中程序性坏死的影响所有柱状图要求同上Fig.4 Effects of HSYA pretreatment on necroptosis in lung tissues of severe heatstroke mice.A: Western blotting of RIP1,RIP3,MLKL and MLKL-s358 in lung tissues of heatstroke mice at 2,6,and 12 h during recovery.B:Western blotting of MLKL-s358 in the lung tissues at 6 h during recovery in control,HS and HSYA+HS groups.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group.

在急性肺损伤中存在不同类型的细胞损伤包括凋亡、自噬和坏死，共同促进ARDS 发生发展［11］。在ARDS的研究中细胞凋亡已被广泛研究，但炎症反应在ARDS进程中起重要作用，细胞坏死使细胞裂解物释放到细胞外环境，包括细胞损伤相关分子模式（DAMP）如HMGB1，其可以触发或增敏模式识别受体（PRRs）激发炎症反应［12,13］。然而，坏死在ARDS中很大程度上没有被研究，是基于先前的研究表明坏死是不可逆的，并且不能被调控［14］。而程序性坏死为新发现的一种细胞死亡类型，同细胞凋亡一样受细胞内信号途径的调控［15］。程序性坏死由一类死亡受体诱导，包括肿瘤坏死因子受体（TNFR）1，TNFR2，TLRs和Fas［16］。受体相互作用蛋白激酶(RIP)1和3参与信号通路的调控，形成死亡诱导信号复合体即坏死小体（Necrosome），坏死小体中RIP3使MLKL发生磷酸化，并且磷酸化的MLKL向细胞膜的转运使质膜完整性丧失，随后导致细胞损伤相关分子模式（DAMP）快速，主动和动态释放（如HMGB1），并促进炎症进展及继发性肺组织损伤［17,18］。既往研究表明热打击肺微血管内皮细胞可发生程序性坏死，肺微血管内皮细胞在肺损伤的病理生理中起着非常重要的作用［5］。然而，肺上皮细胞作为肺部的第一道防线在介导肺疾病中同样起着重要作用［11］，我们推断中暑小鼠肺组织中可能发生了广泛的程序性坏死，而不仅限于肺微血管内皮细胞。在本研究中我们使用RIP1活化抑制剂Nec-1预处理小鼠［19］，可明显增加小鼠热耐受性，改善72 h生存率及循环炎症因子水平，同时对肺损伤也有改善作用，证实程序性坏死参与了重症中暑的发生发展，同时在介导肺损伤中可能起着重要作用，我们提取肺组织蛋白检测程序性坏死相关通路，发现在重症中暑早期RIP1水平升高，下游的MLKL磷酸化水平升高，表明重症中暑早期肺组织中就出现程序性坏死。有研究显示，在重症中暑小肠组织中检测到RIPK1、RIPK3和磷酸化MLKL表达水平升高，抑制ROS生成可减轻程序性坏死从而预防肠道损害［20］；
最新研究表明，RIP3依赖的程序性坏死在介导重症中暑MODS起重要作用［21］，单独热应激即可引起RIP3依赖的MLKL磷酸化，从而引起程序性坏死，敲除RIP3可阻断上述生化反应与细胞死亡［22］。在本研究中小鼠肺组织中RIP3表达水平并未出现明显升高，故并未对RIP3的作用进行进一步研究，虽RIP3在肺组织中表达未出现明显变化，但RIP3可能发生磷酸化及其他形式的活化，介导了下游坏死小体生成，在本研究中仅使用RIP1活化抑制剂探讨了RIP1引起的程序性坏死在重症肺损伤中的作用，但与上述文献一致的是，下游的MLKL发生均发生磷酸化，肺组织发生程序性坏死。既往临床和实验室研究证实，细胞外HMGB1浓度在HS早期阶段即显著升高，发挥早期炎症介质作用，与HS预后密切相关［23,24］。在本研究中也再一次证实在重症中暑小鼠早期血清HMGB1水平升高，肺泡灌洗液中HMGB1水平也出现明显上升，使用Nec-1可明显降低肺泡灌洗液中HMGB1水平，表明肺组织早期出现程序性坏死对HMGB1释放可能起着重要作用。

既往研究结果表明血必净可减轻重症中暑小鼠体内炎症反应及内皮细胞损伤，从而改善小鼠器官损伤及生存率［25,26］，血必净还可通过抑制氧化应激及促炎因子生成保护肺损伤［27］。红花为中成药血必净注射液中重要成分，而红花中的主要成分HSYA对内皮细胞起保护作用［28］，HSYA 还可减轻脂多糖诱导的小鼠急性呼吸窘迫综合征［29］，HSYA在重症中暑肺损伤的研究中尚未有文献报道，促使我们对HSYA在重症中暑急性肺损伤领域展开深入研究。本研究结果表明HSYA可明显增加小鼠热耐受性，改善72 h生存率及循环炎症因子水平，同时通过降低肺湿干重比、肺含水量、肺泡灌洗液中白细胞、中性粒细胞、蛋白含量及HMGB1水平从而改善肺组织损伤程度。既往研究表明羟基红花黄色素A可通过抑制脑微血管内皮细胞凋亡在脑卒中中起保护作用［30］，在重症中暑神经损伤中羟基红花黄色素A还可通过抑制自噬调控凋亡［8］，然而羟基红花黄色素A对程序性坏死的调控作用少有文献报道，在本研究中证实HSYA预处理小鼠可抑制MLKL磷酸化，表明HSYA可能通过抑制程序性坏死从而改善肺组织损伤及全身炎症反应。

综上所述，本研究表明程序性坏死在介导重症中暑急性肺损伤中起重要作用，首次证实HSYA药物治疗可通过抑制MLKL磷酸化阻断程序性坏死的发生从而有效改善重症中暑引起的急性肺损伤。