基于网络药理学探讨鹿角方治疗慢性心力衰竭的作用机制

兰真真，瞿惠燕，戎靖枫，杨 涛，杨晓利，周 华

慢性心力衰竭是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征，为各种心脏疾病的终末阶段，因具有较高的发生率与死亡率，已成为严重的公共卫生问题[1]。据统计，心力衰竭病人平均每日至少需使用5种处方药物，加重了病人经济负担，叠加了药物不良反应[2-3]。中药复方因多成分、多靶点、多通路等特点，治疗慢性心力衰竭等机制复杂的慢性疾病具有独特优势。由于中药多成分等复杂性使其主要疗效物质及机制不明确，导致中药不能被广泛接受和应用。

网络药理学是一门以系统生物学、生物信息学和高通量组织学为基础，集药理学和信息网络为一体的综合学科。通过网络生物学与多元药理学结合，系统分析药物治疗疾病网络的干预机制[4]。由此可见，网络药理学的系统特征与中医药的整体观念和辨证论治理论一致，使其成为研究中医药机制的最佳工具。

鹿角方(专利号：ZL 2006 1 0147305.0)是上海中医药大学附属曙光医院心内科治疗心力衰竭的常用方，因其良好的临床疗效已在临床应用数十年。相关研究证实，鹿角方可增强心脏收缩功能，显著改善心力衰竭病人临床症状[5-6]，但作用机制尚未明确。本研究旨在运用网络药理学探讨鹿角方治疗慢性心力衰竭的潜在靶点及作用机制，为鹿角方进一步应用与研究提供科学的理论依据。

1.1 鹿角方成分靶点的筛选 中药成分复杂，一般认为被吸收入血的成分才可发挥作用。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术鉴定出鹿角方的6种入血成分为补骨脂素、异补骨脂素、马钱苷、莫诺苷、红景天苷、宝霍苷Ⅰ[7]。通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取上述6种成分的2D化学结构式，通过化学结构式在SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)检索相关靶点。

1.2 慢性心力衰竭靶点的筛选 以“chronic cardiac failure”“chronic heart failure”为关键词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)数据库中收集汇总慢性心力衰竭的相关靶点。

1.3 蛋白-蛋白互作(protein protein interaction，PPI)网络的构建 利用Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线作图平台对鹿角方作用靶点与慢性心力衰竭相关靶点取交集，并绘制韦恩图。将交集靶点提交至STRING 11.0数据库(https://string-db.org)，生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互作得分(highest confidence)设定为0.9，其余设置均为默认值，构建PPI网络模型。其中节点(node)表示靶点，边(edge)表示靶点间的关系。根据网络拓扑参数筛选关键靶点。

1.4 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 为阐述潜在靶点的生物学效应及在信号通路中的作用，将鹿角方与慢性心力衰竭交集靶点提交至DAVID6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，设定靶点为“official gene symbol”，生物种类设定为“Homo sapiens”，阈值P<0.05，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO功能富集分析结果以条形柱状图形式呈现；
KEGG分析结果以气泡图和表格形式呈现。

1.5 成分-靶点-通路网络图的构建 运用Cytoscape 3.7.2构建成分-靶点-通路网络图，利用Network Analysis工具进行网络拓扑参数分析，包括连接度(degree)、介度(betweenness)及紧密度(closeness)等，根据度值筛选鹿角方的主要活性成分。

2.1 鹿角方相关作用靶点 经SwissTargetPrediction数据库筛选，其中，补骨脂素有效靶点20个、异补骨脂素有效靶点20个、马钱苷有效靶点39个、莫诺苷有效靶点21个、红景天苷有效靶点23个、宝霍苷Ⅰ有效靶点23个，合并后删除重复值共得到有效靶点71个。

2.2 慢性心力衰竭相关靶点 从GeneCards数据库获得慢性心力衰竭靶点9 300个。根据经验，疾病靶点过多时，设定Score大于中位数为疾病的潜在靶点。9 300个靶点中Score最大为108.43，最小为0.13，计算中位数为3.67，故设定Score≥3.67的靶点为慢性心力衰竭的主要潜在靶点。结合OMIM数据库补充相关靶点，合并后删除重复值共得到慢性心力衰竭相关靶点4 655个。

2.3 PPI网络构建 通过Venn平台绘制鹿角方与慢性心力衰竭作用靶点韦恩图，得到交集靶点47个，详见图1。将药物与疾病交集靶点提交至STRING 11.0平台，得到药物与疾病交集靶点的PPI网络，详见图2。去除游离节点后，网络中节点39个、边113条，平均节点度值4.81，平均局部聚类系数0.389，其中蛋白激酶C(PRKCA)、肾上腺素能受体2A(ADRA2A)、肾上腺素能受体2C(ADRA2C)、糖原合酶激酶3β(GSK3B)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)、蛋白激酶Cε(PRKCE)、B细胞κ轻肽基因增强子核因子1(NFKB1)、腺苷酸激酶(ADK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)度值和聚类系数均大于均值，为鹿角方治疗慢性心力衰竭的关键靶点，详见表1。

图1 鹿角方-慢性心力衰竭韦恩图

图2 药物与疾病交集靶点的PPI网络图

表1 关键靶点网络节点参数

2.4 GO功能富集分析 应用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能富集分析。结果显示，47个靶点富集于102个生物学过程(GO-BP)。其中，与慢性心力衰竭发生发展密切相关的有氧化还原反应(oxidation-reduction process)、对缺氧的反应(response to hypoxia)和MAP激酶活性的正调控(positive regulation of MAP kinase activity)等。细胞成分(GO-CC)主要涉及细胞质(cytoplasm)、质膜(plasma membrane)、外泌体(extracellular exosome)、线粒体(mitochondrion)等。分子功能(GO-MF)主要富集于ATP结合(ATP binding)、蛋白质均二聚活性(protein homodimerization activity)、酶结合(enzyme binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等，详见图3。

图3 GO富集分析条形柱状图

2.5 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析显示，47个靶点富集于50条通路。其中，与慢性心力衰竭密切相关的有胰岛素抵抗通路(insulin resistance pathway)、甲状腺激素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、血管平滑肌收缩通路(vascular smooth muscle contraction pathway)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)等。排名居前10位的通路见表2。通过通路气泡图对通路中的相关参数进行可视化分析，气泡大小代表靶点数量，气泡颜色由绿色至红色代表P值由大到小，详见图4。

表2 KEGG富集分析居前10位的通路

图4 KEGG通路气泡图

2.6 成分-靶点-通路分析 将成分、靶点及作用通路导入Cytoscape 3.7.2，构建成分-靶点-通路网络，详见图5。其中圆形代表入血成分，正方形代表交集靶点，三角形代表通路。形状的大小根据度值大小进行排列，度值越大，形状越大。利用Network Analyzer工具对网络拓扑参数进行分析。结果显示，马钱苷连接度为21，介度为0.264 570，紧密度为0.465 839，为鹿角方治疗慢性心力衰竭的主要有效成分，其次为宝霍苷Ⅰ、红景天苷、补骨脂素、异补骨脂素、莫诺苷，详见表3。

图5 成分-靶点-通路网络图

表3 鹿角方主要成分网络节点参数

慢性心力衰竭归属于中医学“喘症”“痰饮”“水肿”等范畴，病位在心，属本虚标实之证。心为阳中阳脏，血脉运行全赖心中阳气的推动。心阳的充足需肾阳不断化生资助，心阳虚可损及肾阳，肾阳虚亦可损及心阳。因此，心肾阳虚贯穿慢性心力衰竭发展的始终。鹿角方是基于心力衰竭发病机制及心肾相关理论创制，由鹿角、补骨脂、淫羊藿、山茱萸、女贞子、沉香组方而成。方中鹿角、补骨脂、淫羊藿、山茱萸皆为温补肾阳之品，以助心阳生发；
女贞子滋补肝肾，寓以阴中求阳之意，加强本方的温阳功效；
沉香行气止痛，为行气理气之佳品，使本方补而不滞，滋而不腻。诸药合用，共奏补心肾之功效，从根本治疗慢性心力衰竭的发生发展。

相关研究表明，各种原因产生的能量减少与心力衰竭的发生密切相关[8]。胰岛素抵抗通路与甲状腺激素信号通路可调节心肌能量代谢，参与心力衰竭的发生发展。甲状腺素是一种必需激素，与生长、凋亡和能量代谢有关。有研究显示，30岁以上的女性甲状腺功能减退可增加10年心血管疾病风险[9]。动物实验表明，甲状腺素可激活AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)通路，促进线粒体复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ激活，逆转能量衰竭和线粒体肿胀，改善心脏功能障碍[10]。胰岛素作为一种代谢激素，与心肌能量、结构、功能和机体存活密切有关。胰岛素抵抗病人因代谢途径改变、能量代谢失衡、心肌收缩力受损等多种机制促进心力衰竭发生[11]。有研究表明，胰岛素抵抗通路失调通过下游蛋白激酶B(AKT)和叉头盒蛋白(FoxO)等信号通路，影响线粒体功能、心脏能量代谢和肾素-血管紧张素系统，促进心力衰竭发生，血管平滑肌收缩通路与VEGF通路是调节血管舒张的重要通路[12]。有研究表明，血管张力和扩张是外周血容量的重要决定因素，可对心室前负荷和后负荷产生影响[13]。血管阻力增加、顺应性降低是慢性心力衰竭病人的重要特征。因此，调节血管舒张在慢性心力衰竭治疗中发挥着重要作用。除调节血管舒缩功能外，VEGF通路通过促进血管新生、抑制心肌细胞凋亡等，延缓心室重构，抑制心力衰竭进展[14-15]。相关研究显示，VEGF缺失的小鼠因循环系统紊乱进展为心力衰竭[16]。本研究结果显示，鹿角方通过多靶点干预多条通路，协同干预慢性心力衰竭发生发展的机制，延缓疾病进程。

目前，临床药物开发的主导模式是针对某一靶点设计最具选择性的配体[17]。然而，单一靶点药物常低于预期临床疗效，一方面由于人体是一个微妙的动态平衡体，另一方面基于任何一种疾病都不是单一靶点作用的结果。网络生物学分析表明，疾病网络一般不受单个节点的影响。针对复杂疾病，需要生物网络中具有协同效应的组合节点，才能产生期望的治疗效果[18]。慢性心力衰竭是一个多种病理机制的复杂疾病，目前临床中常用药物均是针对其中某一环节或靶点发挥作用，导致慢性心力衰竭只能在某一个指标得以改善，从而难以真正抑制心力衰竭的发生发展。

本研究基于网络药理学结果显示，鹿角方通过多靶点、多通路、协同作用慢性心力衰竭发生发展的多个机制，进而发挥协同治疗作用。通过PPI网络分析及富集分析明确了鹿角方治疗慢性心力衰竭的可能机制，即通过胰岛素抵抗、甲状腺激素信号、血管平滑肌收缩、VEGF信号等通路，优化能量代谢，调节血管舒张，提高心肌细胞的抗缺氧能力，保护受损心肌，进而抑制心力衰竭进程。本研究为鹿角方作用机制的研究提供方向。