Hippo通路及其在眼科领域的研究进展

孙启航，谈旭华，罗莉霞

Hippo通路是一个进化上保守的信号通路，它最初在黑腹果蝇中发现[1]，调控许多生物过程，包括调节细胞生长和分化，控制器官大小和再生。哺乳动物Hippo通路的核心组分包括一个激酶级联——MST1/2、SAV1、MOB1和LATS1/2，以及下游效应因子——转录共激活因子YAP和TAZ[2]。这些Hippo通路的核心组分通过调控下游靶基因的转录，参与细胞增殖、分化、迁移和维持干细胞活性等生理活动[3-5]。目前的研究发现，Hippo通路可能与很多眼部组织的发育再生和眼科疾病存在密切联系，本文从Hippo通路的核心组分、生物学作用及其在眼科领域的研究进展进行了综述。

在果蝇体内，Hippo通路核心组分包括由蛋白激酶Wart(Wts)、Salvador(Sav)、Hippo(Hpo)和Mob(Mats)[2]形成的激酶级联，以及下游效应因子Yorkie(Yki)。Hpo在果蝇中发生突变可导致器官过度生长，形成类似河马(Hippopotamus)的外观，故称为Hippo通路。

从果蝇到哺乳动物，Hippo通路是高度保守的。Wts、Sav、Hpo和Mats在哺乳动物中的同源蛋白分别为LATS1/2、SAV1、MST1/2和MOB1。MST1/2与SAV1形成异二聚体，使SAV1、MOB1和LATS1/2激酶磷酸化[6-8]。LATS1/2直接磷酸化Yki同源蛋白YAP(yes-associated protein)和TAZ(transcriptional activator with PDZ-binding domain)，从而抑制其进入细胞核[9-10]。YAP/TAZ是不含DNA结合域的转录调控因子，主要与TEAD(TEA/ATTS domain)家族转录因子结合[11-12]。Hippo通路的活性受到多种信号如机械应力、细胞间接触、细胞极性、代谢状态和生长因子的严格调控，进而控制着YAP/TAZ在细胞核和细胞质之间的定位变化。Hippo通路关闭时(图1A)，未磷酸化的YAP/TAZ进入细胞核中，与TEADs和其他转录因子结合，启动对细胞增殖、分化和迁移至关重要的转录程序。Hippo通路开启时(图1B)，活化的LATS激酶磷酸化YAP/TAZ，导致其与蛋白14-3-3结合并停留细胞质中，最终被降解[13-14]。在核内没有YAP/TAZ的情况下，TEAD通过与转录调控因子VGLL4结合[15-16]，抑制靶基因如结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Cyr61[17]的表达，从而限制组织生长和细胞增殖。

2.1控制器官大小控制器官大小是Hippo通路最常见的生理功能。在果蝇体内，Hippo通路激酶或上游调节因子的突变导致眼、翅膀等器官的过度生长[18]。在小鼠体内，特异性激活Yap1或敲除Mst1/2、Sav1可导致心脏可逆性增大[19]，并且心肌细胞的增殖和凋亡对YAP的调控敏感[20-21]。Hippo通路还可通过响应拉伸和压缩等机械信号来控制器官大小。在体外培养的哺乳动物细胞中，当细胞被拉伸时，YAP和TAZ活性升高，当细胞被压缩时活性降低[22]。

2.2调控胚胎期细胞分化和器官发育Hippo通路在胚胎细胞分化过程中的部分作用已得到证实。敲除Tead4的小鼠胚胎不能分化出滋养外胚层细胞。敲除Lats1/2、Nf2等基因后，所有细胞无法分化成内细胞团来源的组织[23-24]。此外，组织特异性的YAP缺失会导致小鼠心脏、骨骼和肾脏的发育异常[21,25-26]。人体内YAP转录活性缺失也会导致眼部组织的发育异常，例如，TEAD1突变可导致Sveinsson脉络膜视网膜萎缩和Aicardi综合征[27-28]，在视神经裂闭合缺陷中也发现了YAP缺失突变[29]。由此可见，Hippo通路在早期胚胎细胞分化和器官正常发育中起关键作用。

2.3维持干细胞活性和调控组织再生Hippo通路的效应分子YAP/TAZ可调控不同干细胞的功能，YAP能促进胚胎干细胞的多能性[30]，TAZ可调节间充质干细胞的分化[31-32]。小鼠干细胞的基因表达谱显示，YAP和TEAD在多种组织的干细胞中富集[33]，如肠、肝、皮肤和神经的干细胞或祖细胞中均观察到Yap/Taz的高表达[34-35]。Yap/Taz条件性敲除小鼠的肠道再生能力受阻[36]。肝部分切除术后数天内，YAP活性被诱导，可能是肝脏完全再生所必需的[37-38]。成人心肌的再生非常有限，然而，YAP特异性激活可使心肌的再生能力得到一定程度的恢复[39-40]。相反，心脏特异性的YAP缺失会抑制心肌的再生[41]。

2.4在细胞间黏附和接触抑制中的作用接触抑制是贴壁细胞与相邻细胞进行物理接触时停止增殖的现象。细胞之间的相互接触可通过YAP和TAZ来调控细胞的增殖和存活[42]。一种可能的机制是：当细胞接触时，黏附连接蛋白如Crumbs、PATJ、PALS和E-钙黏蛋白可以与YAP和TAZ结合[43]，将YAP/TAZ隔离在细胞连接处，阻止它们进入细胞核，还可通过阻止YAP/TAZ去磷酸化[43]，从而抑制细胞增殖。

3.1Hippo通路在晶状体中的研究

3.1.1维持晶状体上皮细胞极性晶状体的透明性依赖于晶状体上皮细胞的有序排列，即顶端朝向晶状体纤维，基底部朝向前囊膜，称为晶状体上皮细胞的顶端-基底极性。Song等[44]的研究发现，野生型小鼠晶状体中，YAP蛋白与极性复合体蛋白Crb在晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)的顶端连接处共定位，在小鼠晶状体中特异性敲除Yap可导致LEC形态由正常的立方型变扁平，并且Par和Crb极性复合体的顶端定位被破坏，上皮细胞极性紊乱，从而导致小鼠出现白内障。因此，YAP可能通过与极性复合体Par和Crb相互作用，调控它们的定位[22,45]，从而维持正常LEC的极性。

3.1.2调节晶状体细胞增殖和纤维分化正常生理状态下，LEC终身保持增殖和分化。LEC在持续增殖的同时，逐渐迁移至赤道部的过渡区并退出细胞周期，分化为晶状体纤维(lens fibers, LF)细胞。Kumar等[46]发现，晶状体受到的外力牵拉可作为调节Hippo通路的机械信号，改变YAP在LEC中的定位从而调节LEC增殖。YAP的上游负调节因子NF2很可能直接调节赤道部的LEC退出细胞周期[47]，并激活分化为LF细胞的基因如β-晶状体蛋白。但是NF2是直接作用于YAP还是通过经典的Hippo上游激酶(如MST1/2和LATS1/2)作用仍然未知。Dawes等[48]发现，在低浓度成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGF)的刺激下，FGF与受体结合激活MEK-ERK1/2，促进YAP进入细胞核，与TEAD结合促进LEC增殖的基因转录；
而在高浓度FGF刺激下，Hippo信号通路被激活，YAP被MST1/2-LATS1激酶级联磷酸化后与14-3-3蛋白结合，并留在细胞质中，最终导致LEC退出细胞周期，开始纤维分化。

3.1.3Hippo通路与白内障白内障即晶状体混浊，是全球第一位的致盲眼病[49]，其确切的发病机制尚不清楚，近年研究发现，Hippo通路可能参与白内障的发生发展。He等[50]观察到Yap敲除小鼠在出生后1.5mo出现核性白内障，表现为LEC数量减少、纤维细胞脱核异常和Morgagian小球积聚，且晶状体比野生型小。YAP缺失引起白内障的病理过程分为两个方面——主要影响和次要影响。主要影响是YAP缺失会下调与晶状体增殖和发育相关基因如Sox2、Pax6和Dnase2b[51-52]的表达，导致LEC增殖减少。次要影响是YAP缺失加速晶状体细胞衰老并导致晶状体结构蛋白水平降低以及炎症因子水平增加，最终促进白内障的形成。此外，Lu等[53]的研究发现小鼠中Yap1的杂合缺失可导致成年期白内障，大多数Yap1杂合小鼠在出生后6mo时出现了白内障，且晶状体存在多种形态缺陷，包括囊膜破裂、皮质内空泡和纤维断裂。可能的机制是：Yap1基因的杂合缺失导致其靶基因Crim1无法维持足够的表达，使LEC不能持续增殖，从而造成晶状体发育异常和混浊[54]。总而言之，Hippo通路在晶状体上皮的增殖、分化中具有不可或缺的作用，Hippo通路核心成分有望作为研究晶状体发育的重要分子，并且可能有助于某些先天性白内障的诊断和预测。

3.2Hippo通路在视网膜中的研究

3.2.1调节视网膜发育在视泡发育过程中，神经视网膜(neural retina, NR)和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)来自共同的祖细胞[55-56]。在斑马鱼中[57]，YAP/TAZ-TEAD信号在视杯发生过程中处于活跃状态，而yap-/-突变体表现出RPE缺陷，说明YAP和TAZ可调节RPE细胞命运，潜在机制是YAP/TAZ通过与转录因子TEAD结合，从而调节RPE细胞分化。在非洲爪蟾胚胎中，YAP和参与许多发育过程的蛋白PKNOX1[58]相互作用，控制视网膜干细胞中S期的进程并维持基因组稳定。Kim等[59]的研究发现，YAP可能通过促进视网膜祖细胞从G1期过渡到S期，以及加快S期和G2期的进程，从而维持视网膜祖细胞的增殖活性。

图1 Hippo通路的核心组分 A：当Hippo通路关闭时，YAP/TAZ去磷酸化并进入细胞核，在核内与TEAD等转录因子结合，诱导靶基因转录；
B：当Hippo通路开启时，活化的LATS激酶使YAP/TAZ磷酸化，与14-3-3结合，停留在胞质中并被降解，此时TEAD与VGLL4结合，抑制靶基因转录。

3.2.2调节视网膜Müller细胞重编程和纤维分化视网膜Müller细胞在视网膜损伤时能够重新进入细胞周期并产生多能祖细胞，参与视网膜再生[60]，还可以转化为肌成纤维样细胞促进视网膜纤维化[61]。Rueda等[62]的研究发现，YAP可促进Müller细胞表达cyclin D1，重编程为视网膜祖细胞，而Hippo通路激活可通过抑制YAP的活性阻止视网膜再生。在糖尿病小鼠模型的研究中发现[63]，高血糖条件下视网膜Müller细胞中的YAP被激活，从而使Müller细胞发生纤维分化和收缩，并产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和释放促纤维化因子，增加的ECM又反过来激活YAP，形成促进视网膜纤维化的循环，最终导致糖尿病牵拉性视网膜脱离。因此，Hippo通路有助于视网膜再生疗法的研究，如何调控Hippo通路来促进视网膜再生并减少视网膜纤维化是一个值得探讨的问题。

3.2.3参与视网膜微血管生成信号转导和转录因子激活因子3(STAT3)是一种转录因子，调节细胞增殖、分化、凋亡[64]并促进缺血视网膜中的新生血管形成[65]。YAP与STAT3相互作用以促进STAT3的磷酸化激活、核易位和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)转录，从而上调人视网膜微血管内皮细胞的增殖、迁移和血管形成[66]。此外，STAT3通过降低紧密连接蛋白ZO-1和Occludin[67]的表达增加小鼠视网膜血管内皮通透性，从而促进糖尿病视网膜病变的进展。STAT3与YAP的相互作用为视网膜新生血管形成提供了新的治疗靶点。

3.3Hippo通路在角膜中的研究

3.3.1调节角膜上皮细胞增殖角膜上皮在受到损伤后，通过局部角膜上皮细胞的增殖和迁移来覆盖缺损并重建屏障功能，从而修复损伤。YAP的上游调节剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)被证明可通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路调节角膜上皮细胞增殖，并通过PI3K/AKT途径促进角膜伤口愈合[68]。此外，Lee等[69]的研究表明，应激反应蛋白Sesn2的缺乏会增加角膜上皮细胞中活性氧的产生并激活YAP，从而促进角膜上皮细胞增殖。因此，对角膜上皮细胞中的YAP活性进行调节有助于促进损伤修复，而LPA和Sesn2可作为潜在的治疗靶点。

3.3.2调节角膜缘干细胞增殖角膜缘干细胞(limbal stem cells, LSCs)有助于维持角膜上皮的稳态[70-71]，是角膜上皮再生的来源，当角膜损伤后增殖活跃以加速修复损伤[71-72]。Hippo通路的效应分子YAP在调控LSCs增殖分化中具有重要作用。在直径大于4mm的伤口中，YAP激活介导LSCs的活化和增殖，随后迁移以封闭缺损的上皮[73]。Gouveia等[74]提出，角膜伤口愈合过程中基质变硬，诱导YAP激活以抑制ABCG2的表达[75]，从而促进LSCs分化[76-77]。因此，调控YAP的活性可促进LSCs介导的角膜上皮修复。Hou等[78]的研究证明Agrin可以抑制YAP1的磷酸化并调节下游cyclin D1的表达，从而促进LSCs的增殖。

3.3.3Hippo通路与角膜疾病除了调控角膜上皮细胞和LSCs的增殖分化外，Hippo通路在某些角膜疾病中也发挥着重要作用。转录组测序结果显示，在圆锥角膜中，Hippo通路(FAT4、LATS2、TEAD2、TEAD4)的mRNA表达水平与非圆锥角膜相比显著下调[79]。Zhang等[80]发现，在小鼠角膜真菌感染期间，差异基因在Wnt、cGMP-PKG和Hippo通路显著富集。以上研究结果提示Hippo通路可能在圆锥角膜和真菌性角膜炎的发病机制中起重要作用，靶向调控该通路和关键因子可能有助于这些疾病的防治。

综上，Hippo通路有望成为角膜修复和再生疗法的重要靶点，Hippo通路中的某些分子可能成为角膜感染性疾病或遗传性疾病诊断和预后的分子靶标。

3.4Hippo通路在小梁网中的研究既往研究证明，YAP和TAZ在青光眼中随着小梁网(trabecular meshwork, TM)的弹性硬度的增加而上调[81]。最近的研究发现，在人类小梁网(hTM)细胞中，LPA及其受体可通过调节细胞收缩张力来刺激YAP/TAZ的转录活性，并增加CTGF的表达，进而导致ECM的产生增加[82]，也可通过IL-6反式信号转导与YAP、TAZ和STAT3通路相互作用[83]，引起ECM异常重塑从而导致眼内压升高[84-85]。而交联的ECM又会使β-连环蛋白和YAP/TAZ功能失调导致TM变硬[86]。因此，抑制YAP活性可改善hTM细胞中LPA和/或IL-6反式信号转导介导的高眼压。miR-137可通过直接靶向Src来阻断YAP/TAZ的激活，促进细胞生长并抑制hTM细胞中的ECM蛋白表达[87]，因此可能被用作治疗青光眼的新靶点。

3.5Hippo通路在葡萄膜中的研究研究表明，YAP/TEAD可通过结合CD44启动子激活CD44基因转录，或者通过激活靶基因转谷氨酰胺酶2[88]，促进脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成[89]。用YAP-siRNA处理显著降低了小鼠模型中激光诱导的CNV的程度[90]，表明YAP可能是治疗CNV的重要分子靶标。超过80%的葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)携带GNAQ或GNA11的激活突变[91-92]，其编码蛋白Gq/11可能通过激活YAP促进葡萄膜黑色素瘤的发生[93]，在GNAQ和GNA11突变的脉络膜痣中也观察到下游YAP激活[94]。而YAP抑制剂维替泊芬能选择性抑制Gq/11突变的葡萄膜黑色素瘤发生，因此有望成为治疗葡萄膜黑色素瘤的分子靶向药物。

综上所述，Hippo通路在眼组织中主要通过激酶级联传递信号，作用于效应分子YAP/TAZ，从而调控细胞增殖与分化，在角膜、晶状体、视网膜等组织的发育、再生中具有重要作用，Hippo通路的异常激活或失活可引起白内障、青光眼、角膜和视网膜病变等，但具体致病机制尚不清楚。Hippo通路如何受到眼内特有环境如房水、玻璃体中的因子的调控？Hippo通路如何与其他信号通路相互作用，调控眼部组织的生理功能？YAP与何种下游分子相互作用，从而调控眼部组织特异的基因表达？以上问题有待进一步的研究。阐明Hippo通路在眼部组织中的作用机制，不仅能够完善现有研究的理论体系，而且有望在眼科临床中应用，例如，Hippo通路中的基因可为某些遗传性眼部疾病诊断提供预测，Hippo通路激酶(如LATS、MST)和效应分子(YAP/TAZ)可作为某些眼部肿瘤的治疗靶点，或成为监测某些眼部疾病预后的指标。因此，Hippo通路在眼科疾病的防治中具有广阔的应用前景。