小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）积累及其与容重的相关性分析

何贤芳，董 旭，赵 莉，都斌斌，卢茂昂，邓 骋，汪建来

（1.安徽省农业科学院 作物研究所，安徽 合肥 230031；
2.安徽省植物保护与农产品质量安全研究所，安徽 合肥 230031；
3.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；
4.安徽农业大学 农学院，安徽 合肥 230036）

19世纪中后期，小麦赤霉病在长江中下游麦区和东北春麦区普遍发生，在我国冬小麦主要种植区黄淮海麦区和北方冬春麦区仅零星发生[1]。近年来，小麦赤霉病在黄淮海麦区也逐年加重，大流行年份不仅使小麦产量下降10%～50%，而且病菌产生的真菌毒素也会污染籽粒，造成大比例无效低端供给，影响种植效益与食品安全[2-3]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），也称呕吐毒素，是由小麦赤霉病菌禾谷镰刀菌复合群（Fusarium graminearum species complex）产生的单端孢霉烯族毒素[4]，研究表明，DON及其衍生物是小麦籽粒最容易感染的真菌毒素，具有很强的毒性[5-9]，能够引起厌食、恶心、呕吐、腹泻、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时还会损坏造血系统[9]。

在我国居民饮食结构中，粮谷类占比远高于西方国家，因此严格控制谷物籽粒中的DON含量意义重大。我国现行国家标准GB 2761—2017[10]规定小麦等谷物及其制品中DON含量不得超过1 000 mg/kg，GB 13078—2017规定麦类饲料原料中的DON含量不得超过5 000 mg/kg[11]，以上标准是我国强制执行的食品安全标准和饲料卫生标准。DON理化性质稳定，对高压、高热和弱酸环境具有较强的耐受性，谷物磨粉、日常食物烹调和加工等处理方式都很难将其破坏。目前，DON在小麦等谷物及其制品中的污染和防控是全球面临的严峻挑战，研究高效、安全的降解技术，确保消费者安全，已成为世界各国政府和公众关注的热点问题[12]。

如何有效地控制小麦等谷物中真菌毒素的产生，降低真菌毒素的含量，对于保障谷物食用安全具有重要意义[13]。研究表明，不同小麦品种对赤霉病的抗性水平和耐毒素积累能力有显著差异，种植赤霉病抗性品种可以显著降低籽粒中的DON含量[14]。因此，筛选具有稳定抗赤霉病和耐毒素积累的品种是防控赤霉病最经济有效的措施。鉴于此，本试验选用65份不同遗传背景的小麦品种，在自然发病条件下调查不同品种籽粒的赤霉病病粒率（FDK），测定DON、3A-DON（3-acetyldeoxynivalenol）、15A-DON（15-acetyldeoxynivalenol）含量，分析其对籽粒容重的影响，以期筛选具有低毒素积累、高容重指标的小麦品种，从而为可以大面积生产的品种选择利用提供参考。

1.1 试验材料

供试小麦品种65个，其中，河南审定品种7个、安徽审定品种28个、江苏审定品种21个、山东审定品种9个；
白皮半冬性品种56个、红皮春性品种9个，具体品种信息见表1。DON标准品（加拿大TRC标准品公司），3A-DON、15A-DON（北京坛墨质检科技有限公司），纯度均在98%以上。超高效液相色谱-串联质谱仪购自美国Waters公司（型号为XEVO TQ-Smicro），HGT-1000型容重器购自上海东方衡器有限公司。

表1 65份小麦品种名称及来源

1.2 方法

1.2.1 田间设置

2019年10月30日—2020年5月30日于安徽省普济圩农场农业科学研究所试验基地种植。每个品种5行，行长2.5 m，行距0.25 m，每行播种量为10 g，进行常规的田间管理，不防治小麦赤霉病。

1.2.2 性状调查

于小麦完熟期全区收获，脱粒。从收获籽粒中取样，调查500粒籽粒中感染赤霉病的数量（FDK），3次重复[15]。

FDK/%=（赤霉病病粒数/500）×100

千粒重测定：将调查赤霉病病粒率的500粒籽粒样品称重，换算成千粒重，3次重复；
容重测定：采用GB/T 5498—2013（粮油检验容重测定）[16]方法，测定样品籽粒容重。DON含量测定：采用液相色谱串联质谱法[17-18（]LC-MS/MS）检测小麦籽粒中DON、3A-DON、15A-DON含量。

1.2.3 仪器检测条件

液相色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm；
流动相A—水（0.1%甲酸）、B—乙腈（0.1%甲酸）；
流速0.4 mL/min；
进样体积5 μL；
柱温40℃；
洗脱方式为梯度洗脱；
B相初始浓度为5%；
洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

表3 MRM检测参数

前处理方法为：准确称取粉碎混匀的试样20 g（精确至0.01 g）于150 mL三角瓶中，加入20 mL水、40 mL乙腈（1%甲酸）溶液，5 000 r/min匀浆1 min，振荡提取10 min，加入4 g无水硫酸镁和8 g氯化钠，振摇2 min，取上清液至50 mL离心管，5 000 r/min离心3 min，静置。取2 mL上层溶液，氮吹至近干，用甲醇/水（体积比为40/60）定容至2 mL，过0.22 μm有机系微孔滤膜，待超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测。

1.2.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0统计学软件进行数据整理及分析。

2.1 65个小麦品种籽粒FDK与DON含量及容重

由表4可知，随着FDK的增大，籽粒中3A-DON、15A-DON及DON-Total的积累量逐渐增加，平均容重下降。从品种的FDK分布看，FDK在0.01%～2.00%的品种有34个（占比52.31%），DON和DON-Total含量分别为1.68、1.83 mg/kg，毒素含量均低于国家标准要求的2 mg/kg；
FDK在2.01%～4.00%的品种有18个（占比27.69%），DON和DON-Total含量分别为2.39、2.57 mg/kg；
FDK在4.01%～6.00%的品种有9个（占比13.85%），DON和DON-Total含量分别为2.72、2.94 mg/kg；
FDK≥6.01%的品种有4个（占比6.15%），DON和DON-Total含量分别为2.70、2.96 mg/kg。不同FDK级别的平均容重为L1（754.12 g/L）＞L2（748.59 g/L）＞L3（744.61 g/L）＞L4（740.60 g/L），只有L1级别的籽粒平均容重达到三等小麦标准，其他级别的小麦籽粒平均容重均未达标。65个小麦品种容重在750.00～770.00 g/L的品种有23个，770.00～790.00 g/L的品种有10个，在790.00 g/L以上的品种仅有2个。

表4 65个小麦品种籽粒FDK与DON含量及容重

2.2 不同抗性小麦品种籽粒中DON积累量与容重的相关性分析

由图1可知，FDK与小麦籽粒中积累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.514、0.549、0.529、0.521；
与容重呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.254。籽粒中积累的DON、3A-DON、15A-DON含量两两之间呈极显著正相关（P＜0.01），且与DON-Total呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.999、0.911、0.899；
与容重呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.502、-0.504、-0.481。综上所述，FDK越高，籽粒中积累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量越高，容重越小，商品等级越低。

图1 不同品种指标间相关性分析

2.3 不同来源小麦品种籽粒中DON积累与容重表现

不同来源小麦品种赤霉病抗性表现见图2。65份小麦品种来源于江苏21份（占32.31%）、安徽28份（占43.08%）、山东9份（占13.85%）、河南7份（占10.77%）。从样品籽粒FDK均值看，不同来源样品表现为江苏（1.73%）＜安徽（2.22%）＜山东（3.64%）＜河南（4.26%），说明江苏小麦品种的赤霉病抗性整体最优。从不同品种来源看，籽粒中DON积累量表现为江苏（1.51 mg/kg）＜安徽（2.06 mg/kg）＜河南（2.75 mg/kg）＜山东（2.98 mg/kg）；
3A-DON含量表现为江苏（0.047 mg/kg）＜安徽（0.075 mg/kg）＜山东（0.111 mg/kg）＜河南（0.113 mg/kg）；
15A-DON表现为江苏（0.059 mg/kg）＜安徽（0.090 mg/kg）＜山东（0.132 mg/kg）＜河南（0.141 mg/kg）和DON-Total表现为江苏（1.61 mg/kg）＜安徽（2.23 mg/kg）＜河南（3.00 mg/kg）＜山东（3.23 mg/kg）。不同来源小麦籽粒中DON≤2 mg/kg的品种数及占比表现为安徽（18个，64.29%）＞江苏（13个，61.90%）＞山东（2个，22.22%）＞河南（1个，14.29%）。籽粒容重是衡量收获小麦商品等级的重要标准。由图2可知，不同来源小麦品种的容重均值表现为江苏（758.57 g/L）＞安徽（751.90 g/L）＞河南（739.71 g/L）＞山东（735.27 g/L），江苏和安徽的小麦籽粒容重均值达到三等小麦水平，商品品质好于河南、山东二省，这与江苏和安徽小麦品种籽粒中较低的FDK和DON积累量相吻合。

图2 不同来源小麦品种籽粒中DON积累量与容重

2.4 不同小麦品种籽粒中DON积累量、容重差异性分析

不同小麦品种籽粒中DON积累量与容重差异见表5。由表5可知，品种间赤霉病抗性存在差异，不同品种间FDK变幅为0.20%～7.80%，均值为2.48%，变异系数为0.73，FDK最小的品种为V57和V58，最大的品种为V45。从DON积累量来看，不同品种间DON含量为0.11～4.26 mg/kg，均值为2.08 mg/kg，变异系数为0.46，积累量最小的品种为V58，积累量最大的品种为V1。3A-DON和15A-DON积累量最小的品种相同，均为V57、V58、V59、V60，二者积累量最大的品种均为V1。从DON-Total含量看，积累量最小品种为V58，积累量最大的品种仍为V1，不同品种间差异较大，变幅为0.11～4.65 mg/kg。65个品种容重为703.00～791.70 g/L，容重最低的品种为V19，最高的品种为V7。筛选出自然发病条件下DON≤2 mg/kg且容重≥770.00 g/L品种8个，分别为V17（淮麦40）、V18（淮麦44）、V29（农麦152）、V31（荃麦725）、V44（涡麦9号）、V47（徐农029）、V54（淮麦45）和V59（国红6号）。

表5 65份小麦品种籽粒DON含量、容重差异性分析

3.1 不同小麦品种籽粒DON含量存在差异

研究表明，DON在不同类型小麦籽粒中分布不同，主要集中在赤霉病病粒、发芽粒等不完善粒中[19]。小麦中DON含量与不完善粒之间存在正相关性，特别是与赤霉病病粒和发芽粒之间存在显著的正相关关系，而在色泽正常颗粒饱满籽粒中分布较低[20-21]，这与本试验结果一致。本试验结果表明，自然发病条件下65个品种间DON含量为0.11～4.26 mg/kg，DON-Total为0.11～4.65 mg/kg，说明不同品种毒素积累存在差异。随着籽粒中FDK增加，样品中DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total的积累量增加，并且均与FDK呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.514、0.549、0.529和0.521，由此可知，虽然不同品种赤霉病感染程度对DON积累响应不同，但积累趋势一致，表现为籽粒中FDK越高，DON含量越高。积累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量与容重呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.502、-0.504、-0.481、-0505，说明样品籽粒中积累的DON含量越高，样品容重越小，籽粒商品等级越低。安徽省铜陵市赤霉病发生强度较安徽沿淮、淮北地区常年偏重，试验在自然发病条件下，筛选出8个DON≤2 mg/kg且容重≥770.00 g/L小麦品种，其中半冬性品种7个（分别为淮麦40、淮麦44、农麦152、荃麦725、涡麦9号、徐农029、淮麦45），春性品种1个（国红6号）。试验结果可为小麦生产和品种选择利用提供参考依据，同时建议将抗（耐）真菌毒素积累分析纳入小麦育种及生产品种利用评价体系中。

3.2 不同来源小麦品种赤霉病抗性水平存在差异

当前小麦生产上存在品种多、乱、杂现象，不同小麦品种间存在赤霉病抗性差异较大的情况。由于赤霉菌是半腐生菌，不存在对其免疫的小麦品种。目前抗病品种可通过延缓病菌在穗部扩展以降低毒素积累，而对感病品种而言，基本上是可防不可治[22]。因此持续开展不同小麦品种赤霉病抗性鉴定，培育和筛选抗（耐）赤霉病小麦品种尤为重要。本试验结果表明，65个不同来源的小麦品种中，江苏省小麦品种的赤霉病抗性表现最优，籽粒FDK和DON含量最低，籽粒商品性最好。从各省DON含量≤2 mg/kg品种数和占各自省份材料比例看，安徽（18个，64.29%）＞江苏（13个，61.90%）＞山东（2个，22.22%）＞河南（1个，14.29%），说明近年来在安徽审定的品种赤霉病抗性有所提高，同时也说明在一定发病压力下的持续定向选择有助于品种整体抗性的提升。

3.3 小麦育种科研工作中籽粒DON含量的初步鉴定方法

DON是小麦中检出率最高、危害最严重的真菌毒素，已成为关系粮食安全和食品安全的重要问题。实时了解DON的污染情况并有针对性地对其防控，对确保粮食和食品安全具有重要意义，因此，世界各国政府都十分重视对DON的污染分析和定期监测[12]。目前，常用的DON检测方法有酶联免疫吸附检测[23]、高效液相色谱法[24-25]、色谱-质谱联用法[26]等，这些方法都具有专一性强、灵敏度高等优点，但不同方法还存在“需要高质量的抗体”[23]以及“专业检测设备”“样品前处理繁琐耗时长”“检测费用高”等应用问题[26]，应用于日常、现场粮食收购或大批量育种材料等普及型检测中还较为困难。熊前程等[27]研究表明，收购过程中小麦籽粒中DON含量随着赤霉病粒的增加而逐渐增加，同时劣化品质。樊平声等[28]用DON含量对小麦赤霉病损失率进行评估得出小麦乳熟期病情指数达到0.4%～3.2%，麦谷中DON毒素浓度达到1 mg/kg的籽粒将不能作为粮食进行流通。不同小麦品种对赤霉病的抗性水平和耐毒素积累的能力有显著性差异，种植赤霉病抗性品种可以显著降低籽粒中的DON含量[14]，解决小麦赤霉病最有效的途径是培育具有良好抗性的小麦品种[14]。因此，如何利用小麦籽粒容重指标和赤霉病病粒率来初步估算籽粒中DON含量，并在小麦市场收购及抗（耐）赤霉病种质资源创新与新品种选用中加以应用值得进一步探讨。