稳定同位素比值及矿物元素分析技术在水产品溯源研究中的应用进展

白淑艳，王钟强，汤施展，黄丽，覃东立，陈中祥，王鹏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 150070；
2.河北省水产技术推广总站，河北 石家庄 050035）

水产养殖业作为现代农业的重要组成部分，是保障优质蛋白供给和食物链安全的重要物质基础[1]。随着人们生活水平的普遍提高，消费者对高质量、高品质水产品的需求日益增加。水产品的品质主要受其生长环境如气候、光照、水源等诸多因素的影响，优质适宜的生长环境往往能够产出品质优良的水产品，如挪威三文鱼、阳澄湖大闸蟹、五大连池鳙等。品牌效应带来极高的经济价值，为了追逐更高经济效益，冒牌、贴标等虚假销售现象时有发生，如“巴沙鱼冒充龙利鱼”、“洗澡鱼”、“洗澡蟹”等，这不仅影响了消费者安全和权益，也影响了整个食品工业发展。从食品安全和质量的角度来看，水产品地理来源的核实正在成为消费者、经销商和政府部门关切的热点。因此，开发广泛、快速、廉价和可靠的水产品溯源方法极为重要。目前水产品的溯源技术发展迅速，如稳定同位素比率分析[2]、矿物元素分析[3]、色谱、近红外光谱分析[4]、核磁共振[5]和有机成分指纹分析[6]等技术，正逐渐成为水产品质量安全方向的研究热点。其中，矿物元素及稳定同位素比值分析技术因能够反映水产品产地环境特征和自身饮食特征，且具有灵敏度高、可靠性强等优点在水产品溯源研究中应用广泛、效果突出。本文通过综述近十年来稳定同位素比值及矿物元素分析在水产品溯源应用中的最新研究进展，并对其发展趋势进行了展望，以期为水产品溯源研究提供参考。

1.1 稳定同位素比值分析技术原理

质子数相同，中子数（或质量数）不同的原子（核素）互称为同位素，包括稳定同位素和放射性同位素两大类。同位素组成常用同位素比值（δ）表示，其表达式定义如下：

式中：R样品和R标准分别表示样品以及标准物质中重同位素与轻同位素的丰度比[7]。由于同位素质量不同，在各种地球化学过程中会引起其在不同化合物和物相中的丰度变异，称为同位素分馏，它是稳定同位素分析技术溯源的基本原理和依据[7]。稳定同位素被称为天然的生态记录器，可以提供关于水、食物、饮食甚至生产过程中有价值的生物地球化学信息。因此，水生生物之间同位素比值的差异可以根据生态位反映不同的地理种源、饲料类型或生境。目前，常用于水产品溯源的同位素包括：δD、δ18O、δ34S、δ13C、δ15N、87Sr/86Sr 和143Nd/144Nd。测定方法包括元素分析仪-同位素比率质谱法（Elemental analyzer-isotope-ratio mass spectrometry，EA-IRMS）、热电离质谱法（Thermal ionization mass spectrometry，TI-MS）或多接收器电感耦合等离子体质谱法（Multi-collector inductively coupled plasma mass spectrometry，MC-ICP-MS）等。

1.2 稳定同位素比值分析技术在水产品溯源中的应用

表1 为应用稳定同位素分析对水产品溯源的相关研究。动物组织中δD、δ18O 值通常受环境因素（如水）和食物（受温度、降水和地表水）等的影响。相关研究表明δD、δ18O 值受纬度影响较大，由蒸发、冷凝和降水引起的δD 和δ18O 的分馏有助于确定地理来源。例如，利用肌肉中的δD 值可以对澳大利亚对虾（Penaeus orientalis）和进口对虾进行有效鉴别[13]。C、N 同位素在溯源研究中应用较为广泛，肌肉样品中的δ13C 和δ15N 值通常受食物、季节和温度的影响。采用C、N 同位素比值可将黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）[14]、大西洋鲑、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[15]等野生和养殖群体进行有效区分。Camin等[16]指出，动物组织中的有机结合硫可以追踪栖息地。对底栖生物马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）的产地溯源研究[12]表明，δ34S 值比δ18O 和δD 有更好的地域指示性。吴浩等[8]采用表皮、鳞片中的δ13C、δ15N、δ34S 值对法罗群岛、挪威、智利、加拿大、澳大利亚的三文鱼以及中国虹鳟进行了有效区分。

表1 基于稳定同位素比值分析技术的水产品溯源研究Tab.1 Research on traceability of aquatic products based on stable isotope ratio analysis technology

与轻质同位素不同，放射性同位素在生物地球化学过程中主要表征地质环境信息且不会被分馏，它能弥补气候条件相似的情况下轻质同位素溯源效果不佳的缺陷[7]。例如，87Sr/86Sr 值可以提供独特的信息来帮助追踪水和食品的来源。生物体内的87Sr/86Sr 值取决于当地的地质条件，不同性质的土壤和水中87Sr/86Sr 值通常不一致，据此可以将不同地区的生物进行区分。研究表明，植物和动物的锶同位素组成与其地理起源的锶同位素组成有很好的相关性[17]。对不同产地的中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）锶同位素的分析表明，蟹样品中的锶同位素比值和水环境密切相关，而与外源饲料相关性不大[11]。与锶不同，钕同位素因水团而异，钕同位素比率在海洋环境中变化很大，主要是通过反映周围烃源岩的地质年龄，因此也作为追踪地理起源的示踪剂。目前锶和铷同位素还未被广泛的应用于水产品的产地溯源。Won 等[12]对来自朝鲜、韩国和中国的马尼拉蛤蜊 样本中δ13C、δ15N、δ18O、δD、δ34S、87Sr/86Sr和143Nd/144Nd 值进行分析，LDA（线性判别分析，Linear discriminant analysis）表明同位素比值能很好的实现三个地区的产地判别。

2.1 矿物元素分析技术原理

矿物元素是生物体内基本组成成分之一，是参与生物代谢的重要物质，而生物体内的矿物元素含量受水、土壤环境组成以及当地环境因素（如降雨、温度、日照等）的影响[7]。不同地域或水域的矿物元素分布及组成存在差异，导致来自不同产地（生产方式）的生物体内矿物元素的含量及组成情况也表现出各自的特征，这种特征性差异可对农产品进行有效溯源。随着电感耦合等离子体质谱和电感耦合等离子体发射光谱法的广泛应用，水产品中多种矿物元素的同时测定已成为可能，极大的提高了检测效率，降低了该溯源方法的成本。常用于溯源研究的矿物元素主要有Mn、V、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo、Pd、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pb、U 等。检测技术包括电感耦合等离子体质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、电感耦合等离子体-原子发射光谱法（Inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES）和原子吸收光谱法（Atomic absorption spectrum，AAS）等。

2.2 矿物元素分析技术在水产品溯源中的应用

鱼类组织的元素组成与周围水生环境之间的相关性已被证明是长期稳定和一致的，且矿物元素在水生生物中的稳定性明显高于有机化合物，因此它们可作为地理分类中重要的标记物[18]。鱼类整体的常量和微量元素组成在很大程度上与食物、植被或饲料的元素含量有关。而动植物饲料中元素的含量是生物有效元素从土壤中被调动的结果，因此水产品中元素的含量能够反映地理区域的整体特征。例如，由于一些碱性金属（Rb 和Cs）可以很容易地从土壤中迁移出来，不同的地理位置导致这些元素在鱼类组织中的富集程度有所差异[19]。其他微量元素，如B 和As，则是由火山和地热活动自然进入水环境的[20]，因此，它们在水产品组织中的含量可以用来区分具有特定地球化学特征的海洋动物。此外，一些主、微量元素如Li、Mg、Ca、Sr、Zn、Mn、Cu 等的浓度受到海相盆地盐度的严格控制，更适于海洋鱼类的溯源研究[21]。宋伟等[22]对来自挪威、澳大利亚、智利3 个产地进口大西洋鲑中10 种矿物元素含量进行测试分析，并基于元素Ca、Fe、Cr、As、Al建立了3 个产地的Fisher 判别模型，取得较好的判别效果。

矿物元素分析技术在甲壳类动物的溯源研究中相对较少，但在棘皮类和软体类动物的产地或生产方式溯源中发挥重要作用（表2）。Li 等[23]采用ICP-AES 法分析了来自三个主要出口国（印度、越南和泰国）的虾样品中23 种元素的浓度，通过S-LDA（逐步线性判别分析，Stepwise linear discriminant analysis）筛选了其中的特征元素进行产地判别，判别正确率达到83%以上。

表2 基于矿物元素分析技术的水产品溯源研究Tab.2 Research on traceability of aquatic products based on mineral element analysis technology

利用矿物元素对海参（Apostichopus japonicus）进行产地判别的两项研究中[28,29]，采用S-LDA 对元素进行分类，并根据元素在判别中的相对重要性，建立分类模型，取得不错的效果。在这两项研究对比中发现，测量元素的多少并不是影响分类结果的直接原因。如果冗余或噪声元素没有通过适当的统计来严格评估和删除，那么使用更多元素作为变量构建的模型可能不会优于其他模型。

值得注意的是，在使用矿物元素进行溯源时，许多必需元素如钠、钾、镁和钙的摄取，都受到水产品代谢的调控，导致这些元素与地理来源相关的潜在变化被生理“噪音”所掩盖。而与深海相比，沿海水域或淡水系统的成分异质性更大，因为靠近人为释放源导致一些微量和超微量元素被不同程度地引入。此外，受到某些农业实践或工业活动的影响，镍、锌、砷、铅、汞和镉在海岸线上比在深海的浓度要高[8]。因此，在溯源过程中，对不同来源引入的元素要进行更深入的分析和恰当的评估，使其具有系统性、可识别性和可管理性，并能揭示其地理来源或生产过程，才能使这些元素成为有效的溯源指标。

为了实现更准确、更可靠的产地溯源，近年来，许多研究者尝试将矿物元素与稳定同位素分析联合使用，对水产品进行产地或生产方式进行溯源，相关研究汇总见表3。黄丽英等[31]利用矿物元素与稳定同位素分析结合实现了吕泗渔场、舟山渔场、青海渔场及闽南渔场4 个地区网销带鱼（Trichiurus lepturus）的产地判别。Carter 等[13]利用多元素来区分澳大利亚和亚洲国家的对虾，判别准确率为87%，当与同位素相结合时，判别准确率达到100%。在对养殖和野生虾样品进行判别时[32]，稳定同位素比率和多元素分析的判别准确率分别为70%和93.5%，而两种技术的结合实现了100%的正确分类。

表3 基于稳定同位素与矿物元素相结合的水产品溯源研究Tab.3 Traceability of aquatic products based on the combination of stable isotopes and mineral elements

利用矿物元素和稳定同位素分析结合多元统计分析，判别来自中国8 个产地的164 只商品蟹的地理来源[42]，结果表明，基于δ13C、δ15N 值和Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 含量的SVM（支持向量机，Support Vector Machine）初始判别和外部验证准确率分别达到100%和97%。根据δ13C、δ15N、δ18O、δD 比值和矿物元素含量对来自中国青岛、大连、东营、秦皇岛、福建的海参进行产地溯源时，PLS-DA（偏最小二乘判别分析，Projection to latent structure-discriminant analysis）的总体判别精度达到97.1%，而SIMCA（类类比软独立建模，Soft Independent Modeling of Class Analogy）模型能够达到100%[41]。

大量的研究表明将矿物元素与稳定同位素分析联合使用，能够细化地域信息，筛选更具有特征的分析参数，进而保证分类方法的可靠性。然而，当使用矿物元素与稳定同位素分析结合判别野生和养殖鲑鱼时，发现使用矿物元素或稳定同位素比率对判别效果影响不大，但训练分类模型所使用的样本数量以及所选择的分类算法都对结果有很大的影响[36]。因此，分析技术的准确性和可靠性、分类方法的选取、样品数量的多少等因素都会影响水产品产地及生产方式的判别结果。

由于水生生物在其水生环境中元素的存在不仅取决于栖息地的特定地球化学特征，还可能受到自然（如气候、水温、盐度、年龄和动物性成熟）或人为（即外源污染）来源的其他环境因素的显著影响[42]。因此，在进行产地或生产方式的溯源时，需要对整体元素特征进行严格评估。研究表明，多元数据的高级统计方法将更直接、有效，例如识别相似食物样本中常见但隐藏的成分特征、处理包含在基本数据中的独立的互补、对立或冗余信息以及定义分类规则并通过提取有效的重要元素标记来简化分类方法[43]。

对文献的分析表明，最广泛使用的方法是主成分分析（PCA）、聚类分析（CA）、偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）、k 近邻（kNN）、逐步线性判别分析（S-LDA）等。PCA 是一种有价值的统计工具，其目标是最大化数据中的方差信息，并以尽可能少的成分直观地显示。CA 是基于对象/样本组之间的内在相似性，分层聚类分析的结果以树形图的形式呈现。然而，也有替代的数据处理方法，如支持向量机（SVM），类类比软独立建模（SIMCA）分类回归树（CART）和随机森林（RF）等机器学习方法，显示出巨大的潜力和比传统方法更大的优势。如对海参[40]和中华绒螯蟹[42]进行产地判别时，前者采用SIMCA的判别效果要优于PLS-DA，后者采用SVM的判别效果要优于LDA。因此，在对不同种类的水产品进行产地或生产方式的溯源时，应尝试使用多种分类或机器学习方法，找到最适宜的方法使判别效果达到最佳。

矿物元素及稳定同位素分析技术在水产品溯源的应用中正发挥重要的作用，然而也有一些局限性。首先，由于样品制备成本高和设备价格高，进行稳定同位素分析相当昂贵，导致诸如锶、铷等有着较强的地域性的放射性同位素还未被广泛使用，因此，需要降低同位素分析设备的成本，以进一步鼓励在不同于处理食品监测的专门实验室的情况下推广多元素及同位素分析方法，通过持续的技术改进，以及转向逐渐小型化的仪器，可能是今后水产品溯源的一个主要转折点。其次，在统计数据处理方面，PCA 和LDA 得到了更广泛的应用，而一些机器学习算法在挖掘数据中隐藏着巨大的潜力，却一直被忽视。另外，在使用两种技术分析进行水产品溯源时，应考虑环境因素影响的可能性，如气候、降水、岩性、周围的工、农业污染，还需研究地球化学和气象特征在水产品系统中的转移规律。从长远来看，为了正确识别水产品的地理来源和生产方式，还应增加样本量，建立多年的样本数据库，确定同位素和矿物元素测量的可重复性和再现性，为不同地理来源、不同生产方式以及不同种类的水产品生成同位素和矿物元素地图，来完善水产品可追溯体系。