DNA甲基化及其在辐射防护领域的应用

苏丽霞，战景明，古晓娜，薛向明，武宝利

(中国辐射防护研究院，山西 太原，030006)

DNA甲基化是表观遗传学的一种重要形式，在生物学中起重要作用，表观遗传即不改变DNA序列但基因表达水平发生变化，并且这种变化在发育和细胞增殖过程中可以稳定传递[1]。

电离辐射是DNA损伤诱导剂，作用于机体后产生大量电子，这些电子可使分子或原子电离或激发，破坏其重要的化学键，发生不可逆变化，最终导致DNA单链或双链断裂及碱基损伤等生物效应，使细胞功能受损，影响转录、翻译、DNA复制以及有丝分裂等过程[2]。电离辐射还是表观遗传毒性剂，可诱导表观遗传及其调控的改变，尤其是改变DNA甲基化的模式[3]。研究发现电离辐射可诱导全基因组DNA低甲基化，特定基因启动子区DNA高甲基化和重复序列DNA甲基化水平的改变等。

DNA甲基化是肿瘤发生的早期事件，在许多癌变过程的早期就可以检测到DNA甲基化的改变。肿瘤细胞中全基因组DNA甲基化水平低于正常细胞，启动子区域DNA甲基化水平高于正常细胞，因此肿瘤的发生、发展、细胞癌变与DNA异常甲基化密切相关[4]。随着核能及放射诊疗应用越来越广，接触辐射的人员也随之增多，对人类的潜在健康危害也在不断增加，DNA甲基化的作用及影响成为放射生物学、辐射防护学、肿瘤学等领域的研究热点。因此研究DNA甲基化模式的改变，将其作为基因组不稳定性诊断和细胞早期恶变的生物标志物具有重要意义。

本文介绍了DNA甲基化以及电离辐射诱导全基因组DNA、特定基因启动子区DNA甲基化和重复序列DNA甲基化水平的改变，探讨了电离辐射诱导DNA甲基化模式改变的可能机制，介绍了DNA甲基化在辐射防护领域的应用。

1.1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化通常发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的DNA修饰序列。DNA甲基化主要是由一系列甲基转移酶(DNMTs)来完成[5]。目前，已经鉴定出DNMT家族的5个成员，其中DNMT1(DNA甲基转移酶1)、DNMT3A(DNA甲基转移酶3 alpha)和DNMT3B(DNA甲基转移酶3 beta)在哺乳动物细胞中具有功能活性[6]。DNMT1的功能主要是DNA复制过程中甲基化的维持，在模板链的指导下，将母链DNA甲基化模式传递给子链；
而 DNMT3A 和 DNMT3B 主要负责未甲基化位点的甲基化反应发生，在胚胎发生和生殖细胞发育过程中在两条DNA链上产生新的甲基化模式，DNMT3A和DNMT3B 靶向不同的甲基化位点，具体取决于细胞类型和发育阶段[7]。

1.2 DNA甲基化功能

在哺乳动物中，DNA甲基化基本位于胞嘧啶和鸟嘌呤碱基序列(CpG)的胞嘧啶残基中，CpG位点分布不均匀，且基本集中在富含CpG位点的CpG岛上，CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域。真核细胞基因组DNA约70%的CpG位点能够发生甲基化，位于CpG岛的CpG位点在正常的细胞中通常是未甲基化的[8]。但启动子区域CpG位点甲基化状态改变可引起某些基因异常转录，使其表达情况发生变化，进而导致一些疾病的发生发展。

DNA 甲基化与生命活动环节密切相关，DNA甲基化与其他表观遗传改变相互作用，在调控基因表达、发育分化、X染色体失活、基因组印迹、染色质修饰和内源基因沉默方面起重要作用[9]。DNA甲基化是调节遗传信息正确表达的关键表观遗传机制。

此外甲基化水平的变化是引起肿瘤的一个重要因素，甲基化的胞嘧啶位点是基因突变的热点[10]。在肿瘤细胞中，(1)全基因组DNA甲基化水平降低，癌基因处于低甲基化状态，通常会导致癌基因活化、转录表达，形成突变热点从而导致整个基因组不稳定性增加；
(2)启动子区域DNA甲基化水平升高，机体重要基因如细胞周期调节基因、抑癌基因、凋亡基因等处于高甲基化状态，使其转录抑制、失活或沉默，促进肿瘤的发生、发展[11]；
(3)DNA甲基化发生在(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，而5-mC可通过自发或酶促脱氨转化为胸腺嘧啶，使甲基化的CpG突变为TpG，引起基因突变，这也是DNA甲基化促进细胞恶变发生肿瘤的一种机制[12]；
(4)总体甲基化水平低可促进杂合性丢失或高频率的染色体重组改变原有构象，增加基因的不稳定系，同样导致有害基因转录表达[13]。

2.1 电离辐射诱导全基因组DNA低甲基化

Kalinich等[14]通过对4种体外培养的细胞系进行不同剂量的γ射线急性照射，观察在照后24、48和72 h三个时间点的DNA甲基化水平，发现经10 Gy照射后，所有细胞基因组DNA甲基化水平都表现为剂量依赖性降低，且在48 h的时间点下降最为明显，表明了全基因组DNA甲基化的缺失。Tawa等[15]用高效液相色谱法检测5-甲基胞嘧啶含量，研究了小鼠在4、7和10 Gy急性X射线照射后的甲基化水平变化，发现照射后8、24、48、72 h后小鼠干细胞出现全基因组DNA低甲基化。这两项研究均使用高剂量辐射作为单一急性剂量。

Koturbash等[16]首次研究了淋巴瘤前期辐射目标鼠胸腺受辐射诱导的表观遗传学变化，对C57/B1小鼠进行一次5 Gy X射线的急性照射和10天分段的慢性照射，发现急性和分次全身照射显著改变了鼠胸腺中的DNA甲基化模式，导致全基因组DNA低甲基化。

Pogribny等[17]用0.5、l和2.5 Gy X射线急性全身照射C57/B1雄性、雌性小鼠6 h后，肝及脾组织中观察到辐射诱导的全基因组DNA低甲基化，同时用5 Gy急性照射小鼠也发现同样结果，但是慢性照射未有显著变化。Wang等[18]研究也证实了雄性BALB/c小鼠急性暴露于0.5 Gy X射线或长期暴露于分级剂量10天后，血液基因组表现出低甲基化。

梁建庆等[19]用12C6+束对大鼠右侧肺部结构进行照射，通过MethylRAD技术对大鼠心、肝、脾、左肺、左肾组织进行全基因组DNA甲基化检测。研究发现在大鼠相应组织的全基因组DNA出现低甲基化表达。

目前发现高剂量和低剂量电离辐射均可诱导全基因组DNA低甲基化，且其程度因照射剂量、照射方式、照射组织等不同而异。全基因组DNA低甲基化通常被认为是基因组不稳定的标志，会导致一些正常沉默的基因激活，与染色体和基因组不稳定以及突变率增加有关[16]。通常在各种癌症和癌前期都观察到这种现象。

2.2 电离辐射诱导特定基因启动子区DNA高甲基化

特定的基因组位点比其他基因位点对DNA甲基化的变化更敏感。特定基因内的DNA甲基化谱可影响其转录模式，并可被外源应激改变。电离辐射诱导的基因特异性DNA甲基化改变会影响相应表达变化。

Kovalchuk等[20]报道了雄性和雌性C57/B1小鼠在分别接受单次5 Gy和分次剂量共5 Gy X射线照射后，肝脏中启动子p16 INK4的高甲基化，且单次暴露组比分次暴露组更明显，雄性组比雌性组更明显，但在肌肉组织和MGMT启动子区域无明显变化。Romanenko等[21]同样也发现慢性照射肿瘤组织后p16 INK4基因启动子区处于高甲基化状态。

Wang等[18]将30只雄性BALB/c小鼠分为对照组、急性暴露(0.5 Gy X射线)和慢性暴露10天(0.05 Gy/d，10 d)，采用高效液相色谱(HPLC)和MeDIP定量聚合酶链反应(qPCR)研究其甲基化谱，验证了8个基因启动子区高甲基化(Rad23b，Tdg，Ccnd1，Ddit3，Llgl1，Rasl11a，Tbx2，Scl6a15)是相对稳定的，并表示这些基因在放射生物学中可能发挥重要作用。

Song等[22]将暴露在全身辐射下的雄性BALB/c小鼠分成4周1.75 Gy剂量，p16基因启动子区在暴露6个月后胸腺组织有部分位点甲基化水平增高。

2.3 电离辐射诱导重复序列DNA甲基化改变

DNA甲基化的改变不仅限于特定的基因，还可以在重复序列中检测到。重复序列是具有高拷贝的相同或互补的 DNA 片段，构成三分之二的哺乳动物基因组，对调节基因组稳定性与正常功能具有重要作用，其中包括长散布序列1(LINE-1)和短散布序列Alu等。LINE-1和Alu重复序列约占人类基因组的30%，通常被高度甲基化[23-24]。而岛外CpG位点的某些重复序列的DNA低甲基化，致使基因组和染色体不稳定性增加，基因表达受抑制[25-27]。

Aypar等[28]将人类仓鼠杂交细胞系(GM10115)暴露于2 Gy的X射线后，发生了LINE-1的 DNA低甲基化。Koturbash等[29]将C57BL/6J雄性小鼠暴露于两种类型的空间辐射质子和56Fe，在照射后第7天观察到LINE-1的低甲基化，在照射90天后发现LINE-1和其他逆转座子ERV2和SINE B1，以及主要卫星DNA高甲基化。Baulch实验室显示，在暴露于1 Gy的X射线后，RKO癌细胞系中LINE-1元素发生了明显低甲基化；
在同一研究中，在RKO和RKO中均观察到LINE-1和Alu元素的低甲基化[24]。

Rashmi等[30]对人外周血进行照射，分析了LINE-1重复序列的DNA甲基化水平，发现0.1 Gy照射条件下，MRE11A和TNFAα在照射后72 h甲基化水平显著升高；
2.0 Gy照射条件下，LINE1、MRE11A、PARP1、BRCA1、DNMT3A 和 RAD23B在照射后48 h和72 h的甲基化水平显著升高。

综上表明，重复序列的DNA甲基化状态变化受电离辐射的影响，并且这些变化与剂量、细胞、组织、时间和辐射类型有关。

2.4 电离辐射诱导DNA甲基化模式改变的机制

电离辐射导致基因组DNA甲基化模式改变的可能机制有：电离辐射对DNA甲基转移酶的影响、电离辐射诱导的DNA损伤修复和生物体-碳代谢途径的改变。

(1)电离辐射对DNA甲基转移酶的影响

电离辐射会引起各种DNA损伤如双链断裂等，损伤产物会降低DNA甲基转移酶的活性以及mRNA和蛋白表达水平，从而导致DNA低甲基化；
电离辐射对机体水分子的电离和激发作用会产生大量活性氧(ROS)，ROS可作为DNA甲基化的催化剂，可以通过增加DNMTs的表达使启动子区域DNA高甲基化[31]。此外，电离辐射还会影响几种特异性靶向DNA甲基转移酶的micro-RNA，如miR-29家族，miR-141和miR-152，可能导致DNA甲基转移酶mRNA降解以及随后的DNA甲基化改变[32-33]。

(2)受照细胞DNA损伤及其修复状态

电离辐射使全基因组DNA甲基化水平降低，其与DNA链断裂的累积和重组活性的提高有关。直接照射的组织中细胞甲基化的降低可能与这些细胞的修复状态有关。实际上，在修复合成过程中，参与修复和重组的DNA聚合酶掺入的是胞嘧啶而不是甲基胞嘧啶，因此，DNA损伤的诱导以及随后DNA修复和重组机制的激活可能导致DNA低甲基化，即由于暴露于电离辐射引起的DNA甲基化抑制与DNA修复的激活相关[34]。

(3)一碳代谢途径的改变

一碳代谢是一碳单位生成和转移的生物过程，影响生物体中细胞功能和特定生物甲基化反应,主要是影响S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成。正常条件下，甲硫氨酸(MET)在甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的作用下转化为SAM，SAM为DNMT提供其甲基，用于复制后的DNA甲基化维持。但是电离辐射可能会影响甲硫氨酸的合成和/或抑制甲硫氨酸向SAM的生物转化，从而消耗了甲基供体SAM中的甲基，导致复制后的DNA半甲基化[35]。

电离辐射致DNA甲基化可增加基因突变频率对基因表达调控产生影响，将特定基因甲基化水平变化作为辐射损伤的生物标志物具有重要意义。然而目前仅是将特定基因甲基化水平作为辐射损伤标志物的可行性及理论基础进行研究。

Lyon等[36]对MAYAK工人的基因甲基化研究表明，在工人腺癌中，GATA5启动子甲基化程度高，GATA5是正常发育和维持细胞分化所需的转录调节蛋白。推测启动子甲基化使基因失活的频率增加以及靶向肿瘤抑制基因(如GATA5)的增加可能是导致与放射线暴露相关的肺癌风险增加的因素。

Lee 等[37]对核电厂工作人员职业辐射暴露与DNA甲基化的关系进行多元回归模型分析，结果显示，全基因组甲基化水平与辐射作业工人近1.5 年辐射剂量呈负相关，LINE-1甲基化水平与总累积辐射剂量呈正相关。

Alexer[38]对切尔诺贝利核电厂清理工人外周血白细胞中RASSF1A、p16、p14和GSTP1启动子的甲基化水平分析发现P16和GSTP1基因的甲基化与辐射暴露相关。还有研究发现在切尔诺贝利事故后生活在放射性污染地区的肾细胞癌患者中，可以观察到p14ARF和p16INK4A基因异常高甲基化[39]。这些研究提示，将DNA甲基化特异性进一步研究，有可能作为癌症早期诊断的生物标志物。

目前对辐射诱导DNA甲基化的机制了解不够充分，需要有效的方法识别与辐射相关的引发机体发生甲基化的热点基因组[40]。如开发高通量测序方法和强大分析平台用于临床的诊断、治疗以及预后，将会为辐射导致的DNA全基因组和启动子区基因组的改变提供技术支持。开发实用的模型对受照人群的流行病学数据进行分析，评估辐射风险，确定个体放射敏感性决定因素，对研究表观遗传机制以及进一步理解剂量暴露的影响有重要作用。

另外，需要深入了解DNA甲基化诱发肿瘤的机制及去甲基化药物的开发与应用，将其用于抗癌治疗或用作放射治疗敏化剂；
选择适当的配对方式对肿瘤细胞进行特异性甲基化检测；
对早期疾病特别是肿瘤的筛查、评估治疗效果和预后评估中具有重要意义。