基于P38,MAPK信号通路探讨扶正利湿抗癌方含药血清对前列腺癌LNCaP细胞增殖及凋亡的影响

王 鹏,乔泽昀,赵文兵

(1山西省中西医结合医院·山西 太原 030013；
2山西中医药大学·山西 晋中 030619)

扶正利湿抗癌方是本研究团队针对晚期前列腺癌独创的中药组方，在前期研究中发现，扶正利湿抗癌方含药血清能够抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞增殖并诱导其凋亡，说明其可能对去势抵抗性前列腺癌患者有效[1]。然而，扶正利湿抗癌方是否对前列腺癌早期患者即雄激素依赖性前列腺癌有效，却不得而知。为此，本研究通过观察不同浓度的扶正利湿抗癌方含药血清对雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡、p38 MAPK信号传导通路及凋亡相关蛋白表达的影响，探讨扶正利湿抗癌方含药血清对雄激素依赖性前列腺癌的作用及机制。

1.1 实验药物 紫杉10 g，莪术10 g，白术15 g，龙葵10 g，猪苓30 g，桂枝10 g，以550 mL蒸馏水浸泡30 min，煮沸继续煎煮30 min后纱布过滤。将380 mL蒸馏水加入所剩药渣，再次煎煮20 min后纱布过滤。将前后两次滤液予以蒸馏，浓缩至50 mL，生药浓度为1 g/mL。

1.2 实验动物及细胞 健康SD 雌性大鼠32 只，体质量200～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2006-0024。饲养条件为SPF 级，温度为21～25 ℃，相对湿度为45%～60%，全部大鼠自由进食、饮水，每日更换饮水瓶1 次，2 日更换垫料1 次。人前列腺癌细胞LNCaP：购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.3 主要试剂 DMEM培养基：美国Gibco；
胎牛血清：美国Gibco；
胰酶：美国Hyclone；
CCK8试剂盒：日本同仁；
细胞凋亡试剂盒：BD Pharmingen；
p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53、GAPDH抗体：Abcam；
羊抗鼠-HRP：Abmart；
羊抗兔-HRP：杭州华安生物技术有限公司；
蛋白marker：北京全氏金生物技术有限公司。

1.4 主要仪器 240i细胞培养箱：美国Thermo Scientific；
超净工作台：苏州净化SW-CJ-1FD；
MK3酶联免疫检测仪：美国Thermo；
FACSCalibur流式细胞仪，美国BD；
Mini Protean 3 Cell垂直电泳仪，美国Bio-Rad。

2.1 扶正利湿抗癌方含药血清的制备 将大鼠按随机数字法分为空白组、扶正利湿抗癌方高剂量组、中剂量组及低剂量组，每组8只。依照《实验动物学》[2]人与动物体表面积换算公式计算给药剂量，予以灌胃给药。中药低剂量组12.5 g/(kg·d)、中剂量组25 g/(kg·d)、高剂量组50 g/(kg·d)，空白组生理盐水10 mL/(kg·d)；
每日1次，连续灌服10 d。末次给药后1 h后处死大鼠、采血，室温静置30 min，离心(3 000 r/min，15 min,离心半径15 cm)分离血清，56 ℃灭活30 min。

2.2 细胞培养 LNCaP细胞株常规培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中，5%CO2、37 ℃孵箱培养，每2～3 d换液1次，待细胞长满采用胰酶消化、传代。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 CCK-8法检测LNCaP细胞增殖抑制率 取处于指数生长期的LNCaP细胞，以2 000个/孔接种于96孔板，每孔100μL，每组设3个复孔。24 h 后吸去培养液，加入“2.1”4 组血清培养液100μL，培养24 h后吸去培养液。每孔加CCK-8试剂10μL，5%CO2、37 ℃孵箱培养2 h。在酶标仪上检测各组细胞在450 nm 处的吸光值(OD 值)，并计算细胞增殖抑制率(IR)：IR=(1-实验组OD值均数/对照组OD值均数)×100%。

2.3.2 流式细胞仪检测LNCaP细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各分组干预的LNCaP细胞(空白含药血清以及扶正利湿抗癌方低、中、高剂量含药血清干预48 h)，于室温2 000 r/min离心5～10 min，离心半径15 cm，收集细胞；
用预冷1×PBS(4 ℃)重悬细胞1 次，2 000 r/min离心5～10 min，离心半径15 cm，洗涤细胞2 次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106 细胞/mL的悬液；
Falcon试管中加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；
Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温20 ～25 ℃孵育15 min；
上机前5 min再加入5μL的PI染色；
上流式细胞仪检测。细胞凋亡率(AR)=Q2与Q3象限百分比的和。

2.3.3 Western Blot检测p38 MAPK信号传导通路及凋亡相关蛋白的表达 取对数生长期的LNCaP细胞，调整细胞浓度为1.0×106个细胞/孔，接种于培养皿培养至完全贴壁，分别给予不同浓度扶正利湿抗癌方含药血清处理48 h,收集细胞沉淀，用4 ℃预冷的PBS洗涤2次，加入1 mL含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min×5 min，离心半径15 cm。将离心后的上清液分装置于-70 ℃冰箱保存。使用BCA分析测定蛋白质浓度。蛋白质(50 μg)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到PVDF膜上。加入一抗(1∶1 000)，4 ℃条件下孵育过夜，加入二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h 后，滴加ECL 化学发光液显影，暴露于X射线胶片进行可视化。采用美国 BIO-RAD 公司的 Quantity-One 图像分析软件分析各样品目的条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算各蛋白相对表达水平。

3.1 扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞增殖的影响 扶正利湿抗癌方含药血清可明显抑制LNCaP细胞的增殖，并随扶正利湿抗癌方含药血清浓度增加，对LNCaP细胞的抑制率明显升高。见图1。

3.2 扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞凋亡的影响 不同浓度扶正利湿抗癌方含药血清均可诱导LNCaP细胞凋亡，呈浓度依赖性，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2。

3.3 扶正利湿抗癌方含药血清对LNCaP细胞p38 MAPK信号传导通路及凋亡相关蛋白表达水平的影响 不同浓度的扶正利湿抗癌方含药血清作用48 h 后，LNCaP细胞中p-p38 MAPK 水平逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而p38MAPK 蛋白表达水平则无显著变化(P>0.05)。见图3。扶正利湿抗癌方含药血清以剂量依赖性的方式上调Bax、Caspase-3及p53蛋白的表达，而下调Bcl-2蛋白的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

前列腺癌是临床常见的恶性肿瘤，也是西方国家男性癌症相关死亡的第二大原因。在过去几十年中，随着我国饮食结构的改变及人口寿命的大幅增加，前列腺癌在国内的发病率也在增加[3-4]。中医药是治疗肿瘤的主要辅助手段，一方面可以有效地抑制肿瘤生长，另外一方面其副作用相对较小。中医认为虚、毒是前列腺癌的主要病机，其次兼有痰湿瘀，故以扶正攻毒为最主要的治则。通过益气、补血、养阴、温阳进行扶正，同时采用祛瘀攻毒、化湿解毒等药物进行攻毒。本研究团队据此构建扶正利湿抗癌方，经多年临床观察，该方由紫杉、白术、莪术、龙葵、猪苓、桂枝等药材组成，其中紫杉、龙葵消癌散结，猪苓、白术利水化湿，莪术行气活血、消积止痛，桂枝通阳，全方共奏扶正益气、清热利湿、抗癌解毒之功，在临床上治疗前列腺癌患者有较好的疗效。

p38 MAPK 是丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)4个亚家族的一员，其可介导胞外信号向细胞核内传递，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控，在几种不同类型的肿瘤中作为增殖和凋亡的重要介质而发挥作用[5-6]。研究表明，细胞凋亡的机制与活性氧(ROS)的产生有关[7]。近期有证据表明，凋亡通过几种常见的分子相互作用，如p53、Bcl-2家族和PI3K/AKT/mTOR及p38 MAPK信号通路[8]。ROS通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号并诱导MAPK信号介导凋亡的发生[9-10]。此外，在凋亡过程中，细胞内ROS的产生在PI3K/AKT/mTOR失活和MAPK活化中起着至关重要的作用[11]。本课题组前期研究发现，扶正利湿抗癌方主要成分及其含药血清可能通过抑制PI3K/AKt 信号通路诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞的凋亡[1]。

血清药理学方法模拟了中药进入体内产生药理效应的过程，提高了中药研究结果的可靠性[12]。本研究通过CCK-8法检测发现扶正利湿抗癌方含药血清可抑制雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞的增殖，且抑制作用具有浓度依赖性。同时，扶正利湿抗癌方含药血清能够浓度依赖性的诱导LNCaP细胞的凋亡。进一步研究发现，扶正利湿抗癌方含药血清可以并下调Bcl-2蛋白表达水平，而上调p-p38MAPK、Bax、caspase-3及p53蛋白表达水平，而对p38 MAPK 蛋白表达水平无影响。分析其机制，扶正利湿抗癌方含药血清激活LNCaP细胞p38 MAPK信号传导通路，上调p53蛋白的表达，进一步介导凋亡相关蛋白Bcl-2 的下调和 Bax 的上调，激活caspase 家族级联反应，最终导致caspase-3 活化而诱导线粒体途径凋亡的发生[13-15]。

综上所述，扶正利湿抗癌方含药血清可促进雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞凋亡，其机制可能与激活p38 MAPK介导的凋亡途径有关。

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