动物疫病常见样品的采样方法及注意事项

江 蕾，黎纯敏，曾育麟

(西昌市动物疫病预防控制中心，四川 西昌 615000)

随着社会发展，动物交易方式方法越来越多，动物疫病随着动物交易与运输，流传速度越来越快，流传范围也越来越广，表现症状也越来越复杂。动物疫病的诊断与防控已无法完全依靠肉眼判断的结果进行，需要兽医实验室进行相应的动物疫病试验支持。基层兽医人员在接到动物疫病发生报告或排查过程中发现动物疫病时，须第一时间到达动物疫病发生现场进行流行病学调查，并根据不同的动物疫病检测要求采集不同的样品送兽医实验室进行相应检测试验。所以，基层兽医人员对动物疫病样品的采集质量是动物疫病的诊断与防控的基石。本文主要针对动物的血样、组织样品及拭子等动物疫病常见样品的采样原则、操作方法及注意事项进行探讨。

1.1 活畜禽

1)血液样品:在采样前一般禁食8 h，然后根据采样对象、检验目的及所需的血量确定采血的方法与采血部位。禁止采集血肿部位血液。

2)体表样品:采集病变部位与健康部位的交界处、病变部位。

3)拭子:拭子须在指定部位充分旋转。

4)血纸:血液量须浸透采集纸片。

5)粪便：必须是新鲜粪便。

1.2 动物尸体

1)血液。凡是血液凝固不良、天然孔出血的病死动物，首先排除炭疽，然后采集耳尖血。

2)组织样品。①应从胸腔到腹腔，先采实质脏器，最后采腔肠器官等部位，尽量无菌采集，避免外源性污染。②采取的病料必须有代表性，采取的脏器组织应为病变明显部位和健康部位交界处、病变部位，根据不同的疫病或检验目的采取相应的组织样品。③死亡时间不超过6 h。

1.3 环境拭子

选取有代表性的环境进行采样。

1.4 生物安全

1)个人安全。在进入每个采样场地前需要做好个人防护，有条件的使用一次性防护用品，无条件的须在进入下一个场地前对全部个人防护用品使用消毒药或是酒精消毒。

2)动物安全。在采集每一份样品时，都必须使用一次性采样器械，禁止混用。

3)环境安全。①解剖动物尸体时，须防止血水等对环境的污染。②采样过程中和采样结束后产生的各种垃圾，禁止随意丢弃，须考虑环境影响等，做好无害化处理。

1.5 采样顺序

首先采集活畜禽样品，然后再采集动物尸体。

按照参与人员与样品采集数量进行匹配准备。

2.1 器具的准备

1)采样器具:采样箱、解剖器械、普通真空采血管(针)、抗凝血真空采血管(针)、注射器、酒精棉球、干棉球、采样刀剪、推毛剪、5 mL离心管、医用棉签(棉花头无飞絮)、采血滤纸等。

2)辅助器材:冷藏箱、冰袋、双头油性记号笔(一头笔尖为0.5 mm)、签字笔、试管架、密封袋、采样登记表、PBS液(病毒保存液)、利器盒、无害化处理袋等。

2.2 防护用品的准备

一次性防护服、一次性乳胶手套、口罩、防护帽、鞋套、护目镜、面罩、肥皂、免洗酒精等。

2.3 人员准备

至少需要3人，保定人员1人以上，采样人员1人，采样助手1人以上。保定人员负责保定，采样人员负责采样，采样助手负责登记、编号、辅助采样等。

采样方法有采血、采拭子(环境拭子、咽泄鼻眼拭子)、采组织样等。

3.1 采血方法

采血主要针对猪、牛、羊和禽，不同的动物采血部位与采样器械均不同。

1)真空采血针采血。该采血法适用猪、牛、羊、禽身体表面静脉血管采血。具体步骤：用酒精棉球将采血部位消毒(酒精棉球同时可以起到刺激血管作用让血管凸起方便采血)，待酒精干后，采血针要顺着血管水平方向进针，针尖斜进口向上并与皮肤呈30°～45°，针尖刺入血管后立即改变倾斜度，需要顺着血管水平方向前进1/3～2/3针头，并固定针头，让其斜进口面对采血人。采血针刺入后血管后，采血针与软管交界处出现血液说明针尖进入血管，可以继续采血，否则需要重新更换未使用过的采血针换个采血部位再按以上步骤进行。可以采血后，将出血针头插入采血管中，让血液顺着管壁流下，不要让血液对着管底猛冲，待血量达到要求后(3～5 mL)，用干棉球按压针眼，拔出采血针头，轻压止血。在采血管上1/3处用油性记号笔做好唯一性标记。

2)采血盛血器采血。该采血法适用猪、牛、羊、禽身体表面静脉血管、猪前腔静脉采血。①身体表面静脉血管采血。用酒精棉球将采血部位消毒，待酒精干后，针头要顺着血管水平向进针，针尖斜进口向上并与皮肤呈30°～45°，针尖刺入血管后立即改变倾斜度，需顺着血管水平方向前进1/3～2/3针头，并固定针头，让其斜进口面对采血人。针头刺入血管后，一只手固定针头，一只手缓慢抽取血液，针头与针身交界处出现血液说明针尖进入血管，可以继续采血，否则需要重新更换未使用过的采血盛血器换个采血部位再按以上步骤进行。可以采血后，一只手固定针头，一只手缓慢抽取血液，让血液缓慢顺着管壁流下，待血量达到要求后(3～5 mL)，用干棉球按压针眼，拔出针头，轻压止血。在采血盛血器靠近针头的前1/3处用油性记号笔做好唯一性标记。②猪前腔静脉采血。用酒精棉球将采血部位消毒，待酒精干后进行采血。针筒一般为5 mL或10 mL的一次性针筒。由于猪的大小不同，前腔静脉的深浅不一样，要求使用的针头是不一样的。针头太短刺不到前腔静脉，针头太长，则可能刺穿前腔静脉，同样采不到血。成年公母猪宜选用16号(45或50 mm)针头，30 kg以上的成年猪和育成猪选用12号(38 mm)针头，10～30 kg的仔猪选用9号(25 mm)针头，10 kg以下仔猪选择9号(20 mm)针头。15 kg的猪可以仰卧保定，在左侧前腔最凹陷处处垂直进针，一只手固定针头，一只手缓慢抽取血液，针头与针身交界处出现血液说明针尖进入血管，可以继续采血，否则需重新更换未使用过的采血盛血器并换只猪再按以上步骤进行。可以采血后，一只手固定针头，一只手缓慢抽取血液，让血液缓慢顺着管壁流下，待血量达到要求后(3～5 mL)，用干棉球按压针眼，拔出针头，轻压止血。在采血盛血器靠近针头的前1/3处用油性记号笔做好唯一性标记。

3.2 采血部位与保定方法

1)猪的采血与保定方法。①耳静脉。适用于耳静脉明显且较粗的猪，多为经产母猪、公猪、肥猪。保定人员将猪站立或卧倒保定好，特别是将猪耳朵固定好让其不能晃动或摇动，采样助手用手按压住耳根处，让耳朵上的静脉血管充分暴露。采样人员左手牵拉猪耳，让其完全展开，然后采用真空采血针采血方法进行采血。先从耳静脉远心端向近心端进针，一处无法采出血液，将采血处向比前一次采血处靠近心端的血管处移动或是换只耳朵，禁止采集血肿处的血液。②前腔静脉。主要适用于15 kg以下的仔猪，保定人员将其仰卧解剖位或是直立保定，采样人员采用猪前腔静脉采血方法进行采血。

2)牛的采血与保定。①颈静脉。适用于有保定架或是类似的保定装置的地方，保定装置不能被牛随意移动或折断。保定人员将牛头颈部保定好，使牛头向牛身右侧偏仰，采样人员用左手大拇指和其余四指卡住牛颈静脉近心端，让颈静脉充分暴露出来，然后采用真空采血针采血方法顺着颈静脉远心端进行采血。右侧颈静脉无法采血或是采血到一半时牛挣脱开采血针，需要换左侧颈静脉采血。②尾静脉。适用于有柱子或是类似装置的地方。将牛栓在柱子上，将其尾根部提起，在离尾根10 cm左右，第4、5尾椎骨交界中点凹陷处用酒精消毒后垂直进针。一般采用真空采血针采血方法进行采血。采血到一半时牛挣脱开采血针，应换一头牛进行采血。

3)羊的采血与保定。羊采用颈静脉采血操作。保定人员将羊站立保定好，羊头向羊身左侧偏仰，毛长的羊要用推毛剪将采血部位颈静脉处毛除去。采样人员用左手大拇指和其余四指卡住羊颈静脉近心端，让颈静脉充分暴露出来，然后采用真空采血针采血方法顺着颈静脉远心端进行采血。右侧颈静脉无法采血或是采血到一半时羊挣脱开采血针，应换左侧颈静脉采血或是换一头羊进行采血。左侧颈静脉采血，羊头向羊身右侧偏仰。

4)禽的采血与保定。①翅静脉。保定人员将禽保定，右侧向上，采样人员或采样助手牵拉右翅，将右翅暴露出来，扯掉右中翅处羽毛，暴露静脉血管。采样人员采用采血盛血器采血方法进行采血。如果左中翅没有采血成功，换同一只鸡的右中翅或换只鸡进行采血。禁止采集血肿处血液。②趾静脉。保定人员将禽保定，左侧向上，将右脚暴露出来。从右脚第一趾和第二趾处寻找比较粗的趾静脉。采样人员采用采血盛血器采血方法进行采血。

3.3 采集拭子样品

1)环境拭子。在养殖场、办公区、生活区的不同地方(具有代表性和容易藏污纳垢的地方)，比如圈舍过道、饲槽、圈舍壁、排粪污口(沟)、饲料推车、办公室、生活间等地方进行采样，采样人员用棉签在这些地方反复擦拭数次后保存在装有PBS液的5 mL离心管内，并做好采样登记与唯一性标识。棉签在装入离心管时，需在管口将棉棒去掉，只保留棉头进入离心管。一个离心管装多个棉头时，棉头与棉头、棉头与离心管之间需保留一定缝隙，以便棉头充分吸取PBS液。样品唯一性标识用油性记号笔标记在离心管管盖上。

2)咽泄、眼、鼻拭子。将干棉签伸入咽喉部、泄殖腔1.5～2 cm处或眼鼻处轻轻擦拭几次后保存于装有PBS液的5 mL离心管内，并做好采样登记与唯一性标识。棉签在装入离心管时，需要在管口将棉棒去掉，只保留棉头进入离心管。一个离心管装多个棉头时，棉头与棉头、棉头与离心管之间需保留一定缝隙，以便棉头充分吸取PBS液。样品唯一性标识用油性记号笔标记在离心管管盖上。

3.4 采集血纸

主要针对不方便固定保定采血的牛。保定人员将牛头牵住，使用无菌针头戳穿牛耳朵上的静脉血管，用采血纸吸取血液浸透至少0.5 cm×0.5 cm大小。在血纸上做好唯一性标识与采样登记。待血纸阴凉晾干后再与其他采集好的血纸集中存放。

3.5 采集粪便

采集24 h内离采集时间最近的粪便，做好采样登记与唯一性标识。

1)从地上采集牛、马粪便需要采集粪便中间，每份粪便为成年男人拳头大小。

2)从地上采集羊、禽等粪便需要采集最新鲜的粪便，能区分单样的保存为单样，不能区分的保存为混合样品。

3)羊粪便样品需要和羊只一一对应时，应采集直肠粪便，助手将羊站立保定，采样人员左手抬起羊尾，右手戴上指套的食指直接从羊肛门处抠取羊粪，每份样品至少20粒羊粪。

3.6 采集组织样品

采集组织样品主要针对病死动物。应根据临床症状或剖解的初步诊断，有选择地采取组织样品，难以判定疑似病种的要全面采集病料。采取的病料必须有代表性，采取的脏器组织应为病变明显部位和健康部位交界处、病变部位，大小为1 cm×1 cm。应从胸腔到腹腔，先采实质脏器，最后采腔肠器官等部位，尽量无菌采集，避免外源性污染。

根据不同的疫病或检验目的采取相应的组织样品。病料采集后直接保存于灭菌后的采集管内，并做好采样登记与唯一性标识。

1)做好生物安全防护，个人、动物、环境安全缺一不可。采样过程中产生的废弃物须有防泄漏容器收集后做无害化处理。

2)不建议使用大号注射针头加真空采血管的方法进行采样。原因一是无法控制血流采集速度，血液凝集后易形成果冻样，无法分离得到试验用血清；
二是对被采血动物造成的创口可能被自体血压扩大，不利于被采血动物恢复。

3)不建议使用注射器采血与保存血液。原因一是使用注射器采血并保存血液后，无法分离得到试验用血清；
二是使用注射器采血后，使用注射器将血液注射保存于其他容器内，血液凝集后易形成果冻样，无法分离得到试验用血清。

4)采血盛血器不是注射器，是专用的采血工具。

5)禽采血一般采用采血盛血器采血方法。不建议使用真空采血针采血方法，原因一是使用真空采血针采血后，采血真空压力瞬间过大，采血针头极容易被压在静脉壁上，不利于血液采集；
二是使用真空采血针采集的禽血，血液凝集后易形成果冻样，无法分离得到试验用血清。

6)在采血过程中一定要让血液顺着管壁缓慢流下，不要让血液对着管壁或管底猛冲，因为这样会破坏血细胞造成溶血影响实验结果。

7)抗凝血剂应按照疫病检测种类进行选择，如检测非洲猪瘟的抗凝血剂需用乙二胺四乙酸二钠。

8)采集抗凝血时一定要注意，采好血样时要将管子上下轻轻颠倒几次让血液和管子里的抗凝剂充分混合，以防止血液凝集。

9)在采集环境拭子时，可沾取无菌生理盐水或PBS液擦拭环境。

10)采样过程中一定要做好采样表登记和样品唯一性编号，且登记编号和样品编号相符，以便回溯检测结果。

11)样品的唯一性编号须跟随样品，不易丢失、模糊、擦除，建议使用油性记号笔在样品上或样品保存容器表面醒目处进行标记。

12)采好的样品须防泄漏并冷藏运输。非抗凝样品在运输过程中尽量避免晃动。

13)如果样品在24 h内无法送达实验室：48 h内能送达的样品保存在8℃以下的冷藏室中；
2～7 d才能送达，血液样品须分离提取血清，与组织样品等保存在低于-20℃下的冰柜中；
7 d以上才能送达，血液样品须分离提取血清，与组织样品等保存在低于-70℃下的冰柜中。

动物疫病的确诊需要实验室的检测结果支持，样品的真实性和准确性极大的影响试验结果的准确性。只有采样人员具备专业的采样技术和能力，才能够按不同的疫病要求采集不同的合格样品，为动物疫病的防控提供有效的技术支撑。