一测多评法对金铃子散中来源于延胡索的5个生物碱成分含量的同时测定*

任慧，崔小敏，胡静，刘小妹，陈志永

陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003

金铃子散是治疗肝郁血滞、气郁化火的名方，金元时期刘完素《素问·病机气宜保命集篇》中记载：“治热厥心痛，或发或止，久不愈者，当用金铃子散。金铃子，玄胡各一两，上为细末，每服三钱，酒调下。”［1］方中金铃子（川楝子）和玄胡（延胡索）以1∶1配伍，川楝子疏肝行气，清泄肝火；
延胡索行气活血，尤长于止痛，以增强川楝子止痛之功［2］。现代临床实践中金铃子散主要用于治疗慢性肝炎、胆囊炎、胆石症、肝硬化、胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎等疾病［3-4］。药理学研究表明，醋炙延胡索和炒川楝子配伍镇痛抗炎作用尤佳［5］，而其散剂镇痛效果强于汤剂［6］。

目前，对复方的多指标质量评价可通过对多个成分的同时测定实现，而多指标评价导致对照品消耗大，制约了中药制剂中多成分含量测定方法研究，而一测多评法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS）是利用中药中有效成分内在函数关系和比例关系，选择一个廉价易得的有效成分为内参物，通过测定内参物的含量实现多成分同时测定，该法是一种快速、简便，且符合中药特点的质量评价方法，近年来在中药质量控制中被广泛应用［7］。本研究以延胡索乙素为内参物，首次建立了金铃子散中来源于延胡索的延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、巴马汀、去氢紫堇碱5种生物碱成分的一测多评质量控制方法，旨在提供一种快速、简便实现金铃子散中生物碱类成分含量测定的方法，提高金铃子散质量控制水平，为金铃子散的有效性、安全性提供依据。

1.1 仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；
SHIMADZU 2010A-HT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；
KQ-400DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
TG-16WS型台式高速离心机（湖南迈克尔仪器有限公司）；
BS210S型和BT25S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.2 试药炒川楝子（产地：四川，规格：1.0 kg，批号：20180601、20190301）、醋延胡索（产地：陕西，规格：1.0 kg，批号：20181001、20190701）均购于陕西兴盛德药业有限责任公司；
炒川楝子（编号：CLZ20181201）、醋延胡索（编号：YHS20180801）购于西安市老百姓大药房，并经陕西省中医药研究院陈志永副研究员鉴定为正品；
延胡索乙素对照品（纯度99.86%，批号：MUST-18032720）购于成都曼斯特生物科技有限公司；
盐酸巴马汀对照品（纯度≥98%，批号：18082103）、盐酸黄连碱对照品（纯度≥98%，批号：19042602）均购于上海圻明生物科技有限公司；
去氢紫堇碱对照品（纯度≥97%，批号：CHB170220）、紫堇碱对照品（纯度≥98%，批号：CHB171107）均购于成都克洛玛生物科技有限公司；
乙腈、甲醇为色谱纯（美国Thermo Fisher Scientific）；
水为超纯水，磷酸为分析纯。

2.1 色谱条件Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～90 min，16%～24%乙腈），柱温30℃，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，进样量10 μL。在本色谱条件下，金铃子散中5种成分分离度良好，阴性样品无干扰。见图1。

图1 各溶液高效液相色谱图

2.2 金铃子散制备按照金铃子散处方比例称取不同批次炒川楝子、醋延胡索药材，粉碎，过60目筛，制备3批次制剂，编号分别为20191106、20191107、20191108。

2.3 供试品溶液制备精密称取金铃子散制剂2.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇30 mL，超声30 min，放冷，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，取1 mL提取液以离心半径6.3 cm，5000 r/min离心5 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 混合对照品溶液制备分别称取延胡索乙素、盐酸黄连碱、紫堇碱、盐酸巴马汀、去氢紫堇碱适量，精密称定，加70%甲醇水溶液溶解，配制成含延胡索乙素（128.0 μg/mL）、盐酸黄连碱（48.0 μg/mL）、紫堇碱（46.0 μg/mL）、盐酸巴马汀（25.6 μg/mL）、去氢紫堇碱（103.2 μg/mL）的混合对照品溶液。

2.5 阴性样品溶液制备精密称取川楝子药材，按照“2.2”项下金铃子散制备工艺制备阴性制剂，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

2.6 线性范围考察分别精密吸取“2.4”项下混合对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，测定峰面积，以对照品的量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。各待测成分回归方程、线性范围、相关系数（r）见表1。

表1 5个生物碱成分的线性关系

2.7 精密度试验精密吸取“2.6”项下同一份混合对照品溶液，依据“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积。计算得延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、巴马汀、去氢紫堇碱峰面积的RSD分别为0.81%、1.41%、1.33%、1.31%、1.76%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验精密称取同一批金铃子散制剂（批号：20191106）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定5种待测成分的含量，并计算各待测成分含量的RSD值，结果延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、巴马汀、去氢紫堇碱的RSD分别为2.92%、2.35%、1.84%、2.29%、2.70%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、巴马汀、去氢紫堇碱峰面积的RSD分别为0.92%、0.94%、0.42%、1.90%、0.88%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验精密称取已知5个化合物含量的金铃子散样品（批号：20191106）1.0 g，共6份，分别精密加入各对照品适量，依据“2.3”项下供试品制备方法及“2.1”项下色谱条件进行分析，计算各待测成分的加样回收率及RSD值，结果5个生物碱平均加样回收率为96.79%～102.41%，RSD为0.45%～2.67%，表明该方法准确性良好。见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.11 相对校正因子计算参考文献方法，采用多点校正法计算相对校正因子（fs/i）［8］，即以多个质量浓度点计算所得的fs/i取平均值作为定量用的fs/i，计算公式［9］为：

公式（1）中As为内参物峰面积，Cs为内参物浓度，Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分浓度。精密吸取“2.4”项下混合对照品溶液1、2、3、4、5、6 μL进样，以延胡索乙素为内参物，采用多点校正法计算其余4种待测成分的fs/i。fs/a、fs/b、fs/c、fs/d分别为待测成分黄连碱、紫堇碱、巴马汀、去氢紫堇碱。4种 成 分的fs/i分别为0.3705、0.7560、0.2214和0.3332，RSD均小于3.00%。见表3。

表3 以延胡索乙素为内参物的fs/i计算结果（n=6）

2.12 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响分别采用Agilent 1260和SHIMADZU 2010A-HT高效液相色谱仪；
Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱和Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，考察不同仪器与色谱柱对相对校正因子的影响，测得各待测成分的fs/i，RSD均小于5.00%，表明建立的相对校正因子在不同仪器、色谱柱上有良好的适用性。见表4。

表4 不同仪器、色谱柱测得的相对校正因子

2.13 待测成分色谱峰定位对待测成分色谱峰的准确定位是实现多成分一测多评的前提，通常采用相对保留时间或保留时间差值的方法定位，而相对保留时间定位波动较小、较稳定［8-10］。故而选择以延胡索乙素的保留时间相对值作为待测成分定位标准，计算不同高效液相色谱仪和不同色谱柱的相对保留时间（Ts/i），计算公式为Ts/i=Rti/Rts，式中Rti、Rts分别代表待测成分和延胡索乙素保留时间。结果在不同高效液相色谱仪和色谱柱条件下，测得各待测成分相对保留时间Ts/i的RSD均小于5.00%。见表5。

表5 不同仪器、色谱柱测得的相对保留时间

2.14 一测多评法与外标法比较取3批金铃子散样品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录各待测成分峰面积。采用外标法（the external standard method，ESM）计算各待测成分在金铃子散中的含量，借助“2.11”项下建立的相对校正因子计算各待测成分含量，待测成分质量浓度计算公式［9］为：

公式（2）中As为内参物峰面积，Cs为内参物浓度，Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分浓度，fs/i为待测成分与内参物相对校正因子。

将QAMS和ESM的定量测定结果看作两个多维空间向量，计算两者的夹角余弦值得到余弦相似度反映两种方法测定结果的相似性［11-12］，即余弦值越接近1，表明两者相似度越高。夹角余弦值的计算公式为：

公式（3）中cosθ为夹角余弦值，X为QAMS的测量结果，Y为ESM测量结果，i为金铃子散待测样品编号。通过计算各待测成分夹角余弦值均为1.0000，表明QAMS和ESM定量测定结果高度相似，且这两种方法测定结果的相对误差均小于3.00%，见表6。

表6 一测多评法与外标法对5种生物碱成份的测定结果

由表6可知，3批金铃子散中延胡索乙素含量在0.8839～1.0811 mg/g之间，黄连碱含量在0.2258～0.3605 mg/g之间，紫堇碱含量在0.3567～0.4051 mg/g之间，巴马汀含量在0.1064～0.1908 mg/g之间，去氢紫堇碱含量在0.6422～0.8342 mg/g之间；
拟定各成分含量最低值的80%为含量限度，待今后积累更多数据再做修订。因此，暂定金铃子散中延胡索乙素含量不得少于0.7071 mg/g，黄连碱含量不得少于0.1806 mg/g，紫堇碱含量不得少于0.2854 mg/g，巴马汀含量不得少于0.0851 mg/g，去氢紫堇碱含量不得少于0.5138 mg/g。

3.1 含量测定指标性成分的选择生物碱为金铃子散中代表成分，其中延胡索乙素有镇痛、镇静、抗心律失常、抗心肌缺血、抗胃肠道溃疡、保肝等作用［13］，去氢紫堇碱有镇痛、保护心血管等作用［14］，巴马汀有降血糖、抗心律失常、提高免疫功能及抗老年痴呆等药理活性［15］，黄连碱有胃黏膜保护、心肌保护、抑制A型单胺氧化酶、选择性抑制和双重抑制血管平滑肌细胞增殖等活性［15］，紫堇碱有镇痛、镇静等作用［16］。因而选择生物碱有效成分延胡索乙素、去氢紫堇碱、巴马汀、黄连碱和紫堇碱为金铃子散质量控制的指标成分。

3.2 内参物选择延胡索乙素性质稳定，廉价易得，不与其他成分反应，分离效果较好，不受其他成分干扰，因此本研究选择延胡索乙素为内参物，所得相对校正因子稳定性、重现性良好。

基于此，本研究建立了金铃子散中延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、巴马汀和去氢紫堇碱5种生物碱类成分的一测多评含量测定方法。采用不同仪器和色谱柱考察了所建立的相对校正因子耐用性，通过相对保留时间法实现各待测成分色谱峰的定位，通过计算QAMS和ESM含量测定结果的余弦相似度评价QAMS用于金铃子散质量控制的准确性和科学性。本研究结果表明所建立的QAMS法准确、精密，可用于金铃子散中5种生物碱成分含量的测定，可提高金铃子散质量控制水平，推进金铃子散在临床的科学化、规范化应用。